辛雅萍，李天天，王 婉，牛 茼，祝藝菡

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450014

脂肪堆積和高脂血癥是母體妊娠期脂肪代謝的主要變化，妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)疊加胰島素抵抗會(huì)加重母體糖/脂代謝紊亂，影響胎兒的生長(zhǎng)[1]。胎盤(pán)是母體與胎兒之間游離脂肪酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的器官，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(葡萄糖、游離脂肪酸)過(guò)量的狀態(tài)下，胎盤(pán)的脂質(zhì)累積及相關(guān)脂代謝分子改變尚未明確?？扇苄訬-乙基馬來(lái)酰胺-敏感因子附著蛋白受體(soluble NSF attachment protein receptor,SNARE)是介導(dǎo)膜融合的主要蛋白；囊泡相關(guān)蛋白23(synaptosome-associated protein of 23,SNAP23)、突觸融合蛋白4(syntaxin 4,STX4)與靶膜相關(guān)蛋白2(vesicle associated membrane protein 2,VAMP2)可組成SNARE復(fù)合體，不僅可促使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加胰島素刺激的葡萄糖攝取，還可與脂滴進(jìn)行同型融合，促進(jìn)脂肪酸氧化利用[2-3]。本研究分析了GDM孕婦胎盤(pán)組織中SNARE復(fù)合體及其正性調(diào)節(jié)因子Unc-18c的哺乳動(dòng)物同源物(mammalian homolog of Unc-18c,Munc18c)、脂肪酸β氧化限速酶肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)和促脂滴形成蛋白圍脂滴蛋白2(perilipin-2,PLIN2)的表達(dá)水平和相互關(guān)系，進(jìn)一步明確GDM對(duì)胎盤(pán)脂代謝的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2019年5月至2019年10月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診定期產(chǎn)檢和擇期行剖宮產(chǎn)孕婦60例，包括30例GDM孕婦和30例正常孕婦(NGT)。所有孕婦胎兒均為單胎活產(chǎn)。GDM的診斷根據(jù)國(guó)際糖尿病和妊娠研究小組協(xié)會(huì)2010年診斷標(biāo)準(zhǔn)：24～28周行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(75 g OGTT)，空腹血糖及服糖后1、2 h血糖值分別≥5.1、10.0和8.5 mmol/L，其中任意一項(xiàng)異常即可診斷[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①多胎妊娠，吸煙嗜酒，合并妊娠并發(fā)癥。②甲狀腺功能亢進(jìn)癥、自身免疫性疾病、2型糖尿病、1型糖尿病、肝腎功能不全、感染性疾病、心功能不全等。NGT組OGTT正常，無(wú)妊娠并發(fā)癥。本研究方案經(jīng)過(guò)該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有參與者的知情同意。

1.2 一般資料收集收集孕婦的年齡、孕周、OGTT結(jié)果、血糖、新生兒體重、孕期增重及身高等，并計(jì)算孕前BMI。

1.3 血液和胎盤(pán)組織標(biāo)本采集剖宮產(chǎn)前抽取孕婦空腹肘靜脈血5～7 mL，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min分離血清，-80 ℃保存待測(cè)。剖宮產(chǎn)術(shù)中留取胎盤(pán)中央母體面組織兩塊，直徑約為1 cm×1 cm×1 cm，避開(kāi)鈣化灶、血凝塊處組織，用生理鹽水反復(fù)漂洗后置于凍存管中，加入1 mL RNA穩(wěn)定保存液(德國(guó)Qiagen公司)，于-80 ℃冰箱中保存。

1.4 產(chǎn)前血清相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等水平，試劑盒購(gòu)自上海易博生物技術(shù)有限公司。

1.5 胎盤(pán)脂質(zhì)含量檢測(cè)分析天平精確稱取胎盤(pán)組織5 g，采用索氏提取法檢測(cè)脂肪含量[5]。

1.6 胎盤(pán)組織中脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)將胎盤(pán)組織剪碎、勻漿，采用酚氯仿法提取總RNA，Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(7500 Fast PCR儀，美國(guó)ABI公司)檢測(cè)SNAP23、VAMP2、STX4、Munc18c、CPT1和PLIN2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。根據(jù)GenBank提供的cDNA序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程有限公司合成PCR引物。引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間一般資料、胎盤(pán)組織中SNARE復(fù)合體及脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的比較均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Pearson積差相關(guān)進(jìn)行脂代謝相關(guān)基因及臨床指標(biāo)相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦臨床資料比較兩組孕婦年齡、孕周、孕前BMI、孕期增重、TC、HDL、LDL比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GDM組孕婦的TG水平高于NGT組，而GDM組新生兒體重較NGT組新生兒體重增加(表2)。

表2 兩組孕婦臨床資料的比較

2.2 兩組胎盤(pán)組織中脂肪含量及脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較與NGT組比較，GDM組胎盤(pán)組織中脂肪含量升高，SNAP23、Munc18c和CPT1 mRNA表達(dá)水平降低；兩組間STX4與VAMP2 mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)差異(表3)。

表3 兩組孕婦胎盤(pán)組織中脂肪含量及脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較

2.3 GDM組脂代謝相關(guān)基因及臨床指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表4。與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析中，GDM孕婦OGTT空腹血糖水平分別與SNAP23、Munc18c和CPT1 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。GDM孕婦TG水平與Munc18c mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與PLIN2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。而新生兒體重與Munc18c和CPT1 mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)。

表4 GDM孕婦胎盤(pán)組織中脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平之間以及與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

脂代謝相關(guān)基因的相關(guān)性分析中，SNAP23分別與Munc18c、CPT1和PLIN2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，而Munc18c也與CPT1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。

3 討論

近年來(lái)，GDM發(fā)病率不斷升高，嚴(yán)重影響著孕婦和胎兒的健康。孕期高糖、高熱量、高膽固醇和高飽和脂肪酸飲食會(huì)促進(jìn)孕婦高脂血癥的發(fā)生，GDM誘發(fā)的胰島素抵抗又會(huì)加重孕婦的脂代謝紊亂。本研究中，GDM孕婦TG水平較正常孕婦升高，證實(shí)GDM孕婦常伴有脂代謝異常，與以往研究[6]一致。GDM孕婦血脂水平、胎盤(pán)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝與胎兒的脂肪堆積有關(guān)，可增加巨大兒的風(fēng)險(xiǎn)[7]。本研究中，GDM孕婦的新生兒體重較正常孕婦明顯升高，且與脂代謝相關(guān)分子Munc18c和CPT1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，結(jié)合GDM孕婦的高血脂狀態(tài)，提示胎盤(pán)作為脂質(zhì)代謝和游離脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)器官，在母體高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)狀態(tài)下，胎兒生長(zhǎng)發(fā)育及胎盤(pán)脂代謝可能發(fā)生改變。

本研究結(jié)果證實(shí)，GDM孕婦胎盤(pán)脂肪含量較正常孕婦明顯升高，提示在高血脂狀態(tài)下，胎盤(pán)作為母體和胎兒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的“媒介”器官，可能存在脂肪蓄積。胎盤(pán)中脂滴氧化代謝能力下降，可能是脂質(zhì)蓄積的原因之一。SNAP23是組成SNARE復(fù)合體的主要元件，不僅在骨骼肌的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、胰腺分泌中均扮演重要角色，也可參與脂滴與線粒體的融合,為線粒體脂肪酸氧化提供燃料[3,8]。此外，敲除SNAP23可導(dǎo)致線粒體和脂滴之間的復(fù)合物形成減少，線粒體氧化水平下降[3]。本研究中，GDM孕婦胎盤(pán)組織中SNAP23 mRNA表達(dá)水平較正常胎盤(pán)降低。還發(fā)現(xiàn)母體OGTT空腹血糖與SNAP23 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示GDM孕婦高血糖可能通過(guò)降低SNAP23的表達(dá)影響胎盤(pán)脂代謝。而Munc18c作為SNARE復(fù)合體的正性調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)其水平也較正常胎盤(pán)下降，并與SNAP23 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，且與OGTT空腹血糖和TG水平均呈負(fù)相關(guān)，提示GDM孕婦高血糖和高血脂狀態(tài)可通過(guò)下調(diào)Munc18c影響SNAP23的表達(dá)，降低胎盤(pán)脂滴的氧化代謝水平，造成脂質(zhì)蓄積。而SNAP23作為SNARE復(fù)合體的主要元件之一，還可促進(jìn)GLUT4對(duì)于葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，增加胰島素的敏感性[9]。同時(shí)，胎盤(pán)脂質(zhì)蓄積也可對(duì)胎盤(pán)胰島素敏感性、炎癥激活等方面造成不良影響[6,10]。

高糖狀態(tài)下，胎盤(pán)脂肪酸代謝可能發(fā)生改變。研究[11]發(fā)現(xiàn)，GDM孕婦胎盤(pán)的脂肪酸氧化水平較正常孕婦降低50%。CPT1是脂肪酸β氧化限速酶，具有促進(jìn)脂肪酸氧化、減輕胎盤(pán)酯化的作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，GDM孕婦胎盤(pán)的CPT1 mRNA表達(dá)水平明顯下降，且母體OGTT空腹血糖與CPT1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示GDM孕婦胎盤(pán)的脂肪酸氧化利用能力下降，胎盤(pán)CPT1表達(dá)下降可能為胎盤(pán)酯化的原因之一。而促脂滴形成基因PLIN2定位于脂滴表面，可通過(guò)抑制甘油三酯酯酶來(lái)避免脂滴的脂解作用[13]。在相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，PLIN2與SNAP23的mRNA表達(dá)水平存在正相關(guān)，提示二者在脂滴的形成、融合和代謝中具有一定協(xié)同作用，此結(jié)果與以往研究[14]結(jié)果相似。而胎盤(pán)中的PLIN2與SNAP23間的相互作用是否導(dǎo)致葡萄糖的代謝異常，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，GDM不僅可引起胰島素抵抗、糖代謝紊亂，更可導(dǎo)致母體高血脂和胎盤(pán)脂代謝異常。而SNAP23等相關(guān)脂代謝分子參與了胎盤(pán)中脂滴的形成和脂肪酸的氧化代謝等過(guò)程，與脂質(zhì)蓄積以及可能導(dǎo)致的脂毒性密切相關(guān)。胎盤(pán)不僅作為母體和胎兒之間的“營(yíng)養(yǎng)通道”，還作為孕期重要的內(nèi)分泌器官，其自身狀態(tài)和功能與孕婦和胎兒的健康緊密相關(guān)，也需要我們進(jìn)一步關(guān)注。