漸狹葉煙草組培苗生根條件優(yōu)化及在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

趙陸滟，李榮平，吳勁松

(中國科學(xué)院昆明植物研究所/云南省野生資源植物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

栽培煙草(Nicotiana tabacum)是我國最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，但它是四倍體，較大的基因組極大地阻礙了其與昆蟲或微生物互作的研究。漸狹葉煙草(N.attenuata)是一種二倍體的野生煙草，原產(chǎn)于美洲，因其基因組較小、生活周期較短，近些年來逐漸成為煙草屬植物中研究植物與昆蟲、植物與病原菌互作的模式植物[1—3]。

鏈格孢菌(Alternaria alternata)是一種營腐生性生活的病原真菌，其不同病理小種可以侵染煙草、玉米(Zea mays)、小麥(Triticum aestivum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、蘋果(Malus pumila)、梨(Pyrus spp.)等諸多重要農(nóng)作物，每年均造成大量的經(jīng)濟(jì)損失[4]。鏈格孢菌在栽培煙草上導(dǎo)致的病害為煙草赤星病，但目前對植物抵御這種病原菌的防御反應(yīng)研究較少。

近年來，以漸狹葉煙草為模式的研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢菌感染后，植物會產(chǎn)生非常復(fù)雜的防御反應(yīng)，包括植物激素茉莉酸、乙烯和脫落酸信號的激活，植物保護(hù)素東莨菪素和椒二醇的生物合成等[1,5—8]。雖然漸狹葉煙草是研究煙草屬植物和鏈格孢菌互作的良好模式，但是研究中發(fā)現(xiàn)，漸狹葉煙草在轉(zhuǎn)基因過程中組培苗生根非常困難，這極大阻礙了它做為一個模式植物在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用。如果能優(yōu)化條件，讓轉(zhuǎn)基因組培苗快速生根，不僅可以高效率、低成本地獲得轉(zhuǎn)基因苗，還會極大加快抗病等研究工作。

不同植物組培苗的生根實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的植物激素、嘧啶醇及活性炭等可以起到不同的作用。喻娜[9]在研究旱半夏(Pinellia ternata)組培苗生根發(fā)現(xiàn)，低濃度NAA利于生根，IBA處理的整體效果較好，活性炭能較明顯地促進(jìn)組培苗根伸長，使根更粗壯；文清嵐等[10]在研究杉木(Cunninghamia lanceolata)組培苗生根時發(fā)現(xiàn)，IAA和 NAA濃度均以 0.8 mg·L-1誘導(dǎo)生根最好，但I(xiàn)AA比NAA效果更好；孫會兵等[11]對孟士德薰衣草(Lavandula angustifolia)組培苗生根的研究表明，生根培養(yǎng)基加入0.5 mg·L-1CCC能顯著提高生根率，生根試管苗移栽成活率也較高；蔣小滿等[12]在矮生一品紅(Euphorbia pulcherrima)組培苗的生根誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)，100 mg·L-1生根粉能使組培苗生根率達(dá)到76.3%；楊海萍等[13]在影響蘆筍(Asparagus officinalis)離體快繁關(guān)鍵因子的研究中發(fā)現(xiàn)，生根培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1嘧啶醇可顯著提高生根率；陳雄偉等[14]對鼎湖山紫背天葵(Begonia fimbritipula)組培苗生根研究發(fā)現(xiàn)，添加300 mg·L-1活性炭明顯提高生根質(zhì)量并抑制細(xì)芽點(diǎn)分化。

為此，本實(shí)驗(yàn)先以漸狹葉煙草組培苗為材料，進(jìn)行不同濃度 IBA、NAA、IAA、嘧啶醇、CCC、生根粉及活性炭對組培苗生根影響的研究，并利用優(yōu)化的結(jié)果測試其對轉(zhuǎn)基因組培苗生根的影響，最終獲得對轉(zhuǎn)基因組培苗有良好生根效果的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

漸狹葉煙草是一種原產(chǎn)于北美的二倍體野生煙草，為栽培煙草的野生近緣種。在實(shí)驗(yàn)室自交繁殖31代后用于實(shí)驗(yàn)。漸狹葉煙草種子的萌發(fā)和生長實(shí)驗(yàn)參考 Krügel等方法[15]。

1.2 再生苗培養(yǎng)條件

漸狹葉煙草轉(zhuǎn)化和組培過程參考 Krügel等[15]，以1/4 MS替代Peter’s Hydro-Sol為生根基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加并配制 NAA、IBA、IAA、生根粉、嘧啶醇或CCC 濃度為 0、0.4 mg·L-1、0.8 mg·L-1、1.2 mg·L-1、1.6 mg·L-1、2.0 mg·L-1的培養(yǎng)基；活性炭濃度為 0、0.4 g·L-1、0.8 g·L-1、1.2 g·L-1、1.6 g·L-1、2.0 g·L-1的培養(yǎng)基。瓊脂 7.0 g·L-1，pH 調(diào)至 6.0，0.12 MPa，121 ℃，滅菌20 min。其中除活性炭滅菌前加入，其余生長調(diào)節(jié)劑、生根粉及嘧啶醇等先配制母液過濾滅菌后，待培養(yǎng)基滅菌后溫度降至60 ℃再加入。培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，連續(xù)光照 12 h·d-1，光照強(qiáng)度2000 lx。取愈傷上生長至2～3 cm的漸狹葉組培苗，切干凈下部愈傷，接種至上述生根培養(yǎng)基中，每組接種6瓶，每瓶接種2～3株，接種后每天觀察組培苗生根情況，統(tǒng)計組培苗的生根數(shù)、生根率，觀察根及地上部分生長情況。

1.3 轉(zhuǎn)基因再生苗培養(yǎng)條件

以1/4MS+0.8 mg·L-1IBA為轉(zhuǎn)基因再生苗生根培養(yǎng)基，添加瓊脂7.0 g·L-1，pH調(diào)至6.0，121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，連續(xù)光照12 h·d-1，光照強(qiáng)度 2000 lx。取轉(zhuǎn)化了 NaERF1-like或NaMYB44-like RNAi載體的愈傷上生長至2～3 cm的漸狹葉煙草再生苗，切干凈下部愈傷，接種至生根培養(yǎng)基中，每組接種6瓶，每瓶接種2～3株，接種后統(tǒng)計20 d內(nèi)組培苗的生根數(shù)、生根率；對未生根部分轉(zhuǎn)基因再生苗進(jìn)行繼代，并去除下部新長出愈傷后接種至新的生根培養(yǎng)基，再次統(tǒng)計40 d后所有組培苗的生根數(shù)、生根率，觀察根及地上部分生長情況。生根后移栽，待根系生長健壯后，將生根的組培苗用鑷子從培養(yǎng)基中取出，洗去培養(yǎng)基，移栽至38 cm吸濕育苗塊中煉苗2～3周，待根系大部分長出育苗塊后，移栽至育苗袋中，放于(25±2) ℃玻璃溫室內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

生根率(%)=組培苗生根數(shù)/組培苗接種數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度外源添加物對組培苗生根的影響

2.1.1 NAA

漸狹葉煙草組培苗接種至含有不同濃度 NAA的1/4MS培養(yǎng)基中，90 d內(nèi)的生根情況如圖1。結(jié)果表明，對照處理在整個統(tǒng)計過程中均不能生根，但是不同濃度NAA處理均能明顯誘導(dǎo)組培苗生根；NAA處理19 d后組培苗開始出現(xiàn)明顯的根，處理51 d后生根率超過75%，最高可達(dá)100%。雖然NAA處理可以較好地誘導(dǎo)生根，但是苗的根及地上部分生長均受到明顯的抑制，且隨著NAA濃度升高抑制作用逐漸增大。

圖1 不同濃度NAA對組培苗生根率的影響Fig.1 Effects of different NAA concentrations on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.2 IBA

圖2顯示，與對照(0 mg·L-1)比較，不同濃度IBA處理90 d后均能明顯誘導(dǎo)漸狹葉煙草組培苗生根，其中效果最佳的是 0.8 mg·L-1IBA處理，該處理在35 d后生根率可達(dá)72.72%。值得一提的是，不同濃度IBA處理不僅可以誘導(dǎo)組培苗生根，而且苗的根及地上部分生長均正常(圖2)。

圖2 不同濃度IBA對組培苗生根的影響Fig.2 Effect of different concentrations of IBA on rooting of tissue-cultured seedlings

2.1.3 生根粉

統(tǒng)計處理90 d后組培苗生根情況(圖3)，與對照(0 mg·L-1)比較，不同濃度生根粉處理均能明顯誘導(dǎo)組培苗生根，其中誘導(dǎo)生根效果最好的是 2 mg·L-1生根粉處理，該處理在48 d后生根效率可達(dá)75%，說明2 mg·L-1生根粉誘導(dǎo)生根效果最好，但苗的根及地上部分生長均受到明顯抑制，故不推薦使用。而 0.8 mg·L-1生根粉誘導(dǎo)的苗的根及地上部分生長正常，在19 d后生根率達(dá)50%。

圖3 不同濃度生根粉對組培苗生根率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of root powder on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.4 活性炭

漸狹葉煙草組培苗接種至含有不同濃度活性炭的1/4MS培養(yǎng)基中，90 d后均能不同程度地誘導(dǎo)生根，其中0.8 mg·L-1活性炭處理的組培苗10 d后開始長根(圖4)，60 d時生根率達(dá)到最高(53.85%)，且苗的根及地上部分生長均正常。

圖4 不同濃度活性炭對組培苗生根率的影響Fig.4 Effects of different concentrations of activated carbon on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.5 IAA

實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度的IAA對漸狹葉煙草組培苗生根的影響不同(圖5)。不同濃度IAA處理與對照(0 mg·L-1)比較，除1.6 mg·L-1IAA處理外，其他濃度IAA均能誘導(dǎo)組培苗生根，但誘導(dǎo)效果比IBA差，其中生根率最高的是1.2 mg·L-1IAA處理，生根率為33.33%。說明0.4、0.8、1.2和2.0 mg·L-1IAA均能誘導(dǎo)組培苗生根，但是與IBA相比誘導(dǎo)效果較差，但其根及地上部分生長均正常。

圖5 不同濃度IAA對組培苗生根率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of IAA on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.6嘧啶醇

由圖6可見，不同濃度嘧啶醇對漸狹葉煙草組培苗生根的影響不同。不同濃度嘧啶醇處理與對照(0 mg·L-1)比較，均能部分誘導(dǎo)組培苗生根，但誘導(dǎo)效果不明顯，其中1.6 mg·L-1處理21 d開始長根，26 d達(dá)到生根最大值，生根率為33.33%，其根及地上部分生長均正常。

圖6 不同濃度嘧啶醇對組培苗生根率的影響Fig.6 Effects of different concentrations of pyrimidine on the rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.7 CCC

取愈傷上生長至2～3 cm的漸狹葉煙草組培苗，切干凈下部愈傷，接種于含有不同濃度 CCC的1/4MS培養(yǎng)基中，不同濃度的CCC對其生根的影響不同(圖7)。 結(jié)果表明，不同濃度CCC處理與對照(0 mg·L-1)比較，均不能顯著誘導(dǎo)組培苗生根。

圖7 不同濃度CCC對組培苗生根率的影響Fig.7 Effects of different concentrations of CCC on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.2 IBA在漸狹葉煙草轉(zhuǎn)基因組培苗生根中的應(yīng)用

從上述結(jié)果可以看出，0.8 mg·L-1IBA處理不僅可以使組培苗達(dá)到較高的生根率，而且對苗的根及地上部分生長均不會造成不良影響。為此，我們將該處理應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因組培苗的生根實(shí)驗(yàn)(圖8、圖9)。

圖8 IBA處理對漸狹葉煙草轉(zhuǎn)基因組培苗生根率的影響Fig.8 Effects of IBA on the rooting rate of transgenic tissue-cultured plantlets of Nicotiana attenuata

圖9 漸狹葉煙草轉(zhuǎn)NaERF1-like RNAi載體組培苗生根及移栽表型Fig.9 Rooting and transplanting phenotype of transgenic NaERF1-like RNAi tissue-cultured plantlets of Nicotiana attenuata

構(gòu)建NaERF1-like和NaMYB44-like 的RNAi載體，利用農(nóng)桿菌分別進(jìn)行漸狹葉煙草的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。當(dāng)抗生素篩選培養(yǎng)基中新生愈傷上長出2～3 cm漸狹葉煙草再生小苗，切干凈下部愈傷，接種于含有1/4MS+0.8 mg·L-1IBA 培養(yǎng)基中。結(jié)果表明，沒有IBA處理的情況下，轉(zhuǎn)基因組培苗在90 d內(nèi)生根率為0；而0.8 mg·L-1IBA處理極大提高了轉(zhuǎn)基因組培苗的生根率，20 d后NaERF1-like和NaMYB44-like組培苗的生根率分別達(dá)66.67%和58.33%；對于20 d內(nèi)沒有生根的轉(zhuǎn)基因組培苗再切去下部愈傷處理，并繼代至1/4MS+0.8 mg·L-1IBA培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)20 d，NaERF1-like轉(zhuǎn)基因苗總的生根率可達(dá)95%，NaMYB44-like轉(zhuǎn)基因苗生根率達(dá)90%。

后期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1/4MS+0.8 mg·L-1IBA培養(yǎng)基也適用于實(shí)驗(yàn)室其他基因轉(zhuǎn)化的組培苗生根，且均達(dá)到較好的生根效果。

3 討論

近年來，漸狹葉煙草作為煙草屬的一種模式植物，廣泛應(yīng)用于植物與昆蟲、植物與鏈格孢菌互作的研究。但是，在轉(zhuǎn)基因過程中其組培苗生根困難的問題(常有組培繼代 1年不生根)極大地限制了它作為模式植物在研究中的作用。遺憾的是，目前尚無促進(jìn)漸狹葉煙草組培苗生根的報道。

雖然漸狹葉煙草組培苗生根技術(shù)仍處于摸索階段，但在栽培煙草及其他植物中已有相關(guān)研究[16—20]。在植物組織培養(yǎng)過程中，不定芽生根培養(yǎng)受諸多因素影響，培養(yǎng)基是關(guān)鍵因素之一[21]。而植物組織培養(yǎng)中器官分化的關(guān)鍵因素是生長調(diào)節(jié)劑，如 NAA、IBA、IAA、嘧啶醇、CCC、生根粉等常用于誘導(dǎo)植物組培苗根的分化[9,13,16,22—24]，活性炭在誘導(dǎo)生根過程中同樣起著重要的作用[14]。

本研究先以漸狹葉煙草組培苗為材料，測試不同濃度 NAA、IBA、IAA、嘧啶醇、CCC、生根粉及活性炭等外源添加物對組培苗生根的影響。結(jié)果表明，不同濃度NAA處理均能明顯誘導(dǎo)組培苗生根，但根的伸長及地上部分生長均受到抑制，且隨著濃度升高影響逐漸變大，該結(jié)果與在旱半夏[9]和金線蓮(Anoectochilus roxburghii)[25]中的研究結(jié)果一致，產(chǎn)生不良影響的原因可能與外植體產(chǎn)生乙烯等有害物質(zhì)有關(guān)。

IBA和生根粉濃度均以0.8 mg·L-1誘導(dǎo)生根最好，且根及地上部分生長均良好，但I(xiàn)BA比生根粉誘導(dǎo)效果更好，生根率達(dá)72.73%，IBA和生根粉均可以誘導(dǎo)漸狹葉煙草生根，與旱半夏[9]和梭梭(Haloxylon ammodendron)苗木[24]的研究結(jié)果一致。IBA效果相對生根粉較好的原因可能是由于IBA僅含吲哚丁酸一種成分，對誘導(dǎo)生根的作用可能較生根粉穩(wěn)定，也可能與物種本身有關(guān)。

不同濃度活性炭、IAA和嘧啶醇均能誘導(dǎo)生根，但誘導(dǎo)效果均較IBA差，不同濃度矮壯素基本不能誘導(dǎo)生根，此結(jié)果與前人在杉木[10]、紫背天葵[14]、蘆筍[13]和萱草(Hemerocallis spp.)[23]中的研究結(jié)果不一致，可能是因物種間的差異造成的。

因此，本研究發(fā)現(xiàn)并優(yōu)化了促進(jìn)漸狹葉煙草組培苗生根的方法，在1/4MS+0.8 mg·L-1IBA培養(yǎng)基中組培苗最適宜生根。進(jìn)一步測試該處理對漸狹葉煙草轉(zhuǎn)基因苗生根的影響，發(fā)現(xiàn)0.8 mg·L-1IBA的添加，同樣可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化了 NaERF1-like和NaMYB44-like RNAi載體的再生苗生根，培養(yǎng)20 d生根率可達(dá)60%。由此充分說明IBA對漸狹葉煙草組培苗生根的效果。

在同一年齡植物中，傷口損傷是決定根再生的主要因素[26]。本研究中，將20 d內(nèi)未生根的轉(zhuǎn)基因組培苗經(jīng)組培繼代方法優(yōu)化(重新切除下部未生根愈傷，造成新的傷口損傷)，最終可使轉(zhuǎn)基因組培苗生根率達(dá)到90%以上，且根及地上部分生長均良好，移栽后成活率較高。切口損傷促進(jìn)生根可能是因?yàn)樵趥谔幷T導(dǎo)了生長素、茉莉酸和水楊酸的合成，進(jìn)而引起植物根再生。

綜上所述，優(yōu)化的1/4MS+0.8 mg·L-1IBA培養(yǎng)基不僅在漸狹葉煙草組培苗中最適宜生根，且該培養(yǎng)基可以應(yīng)用于漸狹葉煙草轉(zhuǎn)基因組培苗生根，而且結(jié)合傷口誘導(dǎo)，最終生根率可達(dá)90%以上。本研究為高效獲得漸狹葉煙草的轉(zhuǎn)基因生根苗提供了解決方案，為漸狹葉煙草作為煙草屬的一種模式植物研究提供便利，也為其他生根困難的植物提供了方法借鑒。