河南人群親權鑒定中D12S391基因座突變分析

許玲利 張靜 杜祎銘 王若楠 鄭偉森

摘 要： 目的 對河南人群中D12S391基因座突變進行研究分析。方法 從河南事緣法醫(yī)物證司法鑒定所2018-2020年期間1000個親子鑒定案例中整理出家系進行分析，篩選存在等位基因突變案例，應用多重 PCR 擴增技術及毛細管電泳技術進行基因座分型，本DNA進行檢測分析。 結果 在 D12S391基因座2000次傳遞中共出現(xiàn)69次突變，均為1個位點突變，突變發(fā)生的概率男性要大于女性。 結論 準確獲得河南人群D12S391基因座的突變率，當出現(xiàn)疑似突變案例時應增加STR基因座的檢測數(shù)量，并且在計算存在突變案例的 CPI 值時，應考慮不同的人群和地域間、性別的差異，以最大限度地降低誤判風險。

關鍵詞：親權鑒定;D12S391基因座;突變分析;法醫(yī)遺傳學

河南人口眾多，隨著社會的高速發(fā)展，不同民族不同地域之間的聯(lián)姻逐漸增加，導致了人口遺傳信息分析的復雜性[1]。短串聯(lián)重復序列（Short Tandem Repeat，STR）是目前法醫(yī)物證中應用最廣泛的遺傳標記之一，具有高度多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性[2]。在遺傳中也有可能發(fā)生基因突變的現(xiàn)象，因此，這給日常親權鑒定工作帶來了一定難度。 STR基因座突變，是等位基因從親代向子代遺傳過程中發(fā)生改變，表現(xiàn)為真實家系的STR基因座分型結果出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律的現(xiàn)象[3]。D12S391基因座位位于人類第12號，具有復雜的核心序列結構，群體遺傳學研究表明均具有高度的多態(tài)性，在法醫(yī)學同一認定及親子鑒定中具有較高的應用價值[4-5]。通過對實際案例中常染色STR 基因座突變情況的觀察與分析，可以對親子鑒定中突變問題的分析進行指導[6]，同時也能夠為日常親權鑒定工作及群體遺傳學研究提供基礎資料，幫助司法鑒定人在鑒定工作中更有效的判斷突變的發(fā)生及注意回避特殊案例中存在的風險。

1. 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象來自河南省事緣法醫(yī)物證司法鑒定所2018-2020年委托我所進行親權鑒定1000例。所有案例均為三聯(lián)體家系，肯定親權關系，并通過電話征求了當事人同意。每位當事人采集靜脈血0. 5 mL，用 EDTA抗凝，置于-20℃冰箱凍存。

1.2 儀器及試劑

EX22和21+1熒光檢測試劑盒（包括ReactionMix、Primers、Taq酶、Allelic Ladder、AGCU MarkerSIZ-500等）購自無錫中德美聯(lián)生物技術有限公司;GoldenEye_20A系統(tǒng)熒光標記檢測試劑盒（包括2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA聚合酶、PCR Grade Water、Orange-500等）購自江蘇蘇博醫(yī)學科技南京有限公司。GeneAmp 9700熱循環(huán)儀、3500型遺傳分析儀等均來自美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 PCR擴增和電泳分型

用Chelex-100法提取基因組DNA。PCR擴增體系和程序嚴格按照試劑盒說明書操作。每次擴增以陽性對照DNA作陽性對照，用純水代替樣本DNA作陰性對照。用ABI3500 型分析儀進行毛細管電泳和熒光檢測，使用Gene Mapper v3.2 軟件分析基因型。

1.4 統(tǒng)計學與突變分析

根據(jù)試劑盒提供的STR基因座的基因頻率，當出現(xiàn)不符合遺傳定律的基因座時用 AGCU Express marker22 熒光檢測試劑盒驗證突變真實性，用AGCU 21+1 STR試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術公司）補充STR位點，當補充位點均為符合情況時按照親權鑒定技術規(guī)范——司法部《親權鑒定技術規(guī)范》（GBT 37223—2018）和《法醫(yī)物證鑒定 Y-STR 檢驗規(guī)范》（SF， Z JD0105007—2018）計算親權指數(shù)（paternityindex， PI）、累積親權指數(shù)（cumulative paternityindex， CPI），μ為平均突變率0.002。當 CPI≥104時，則確認不符合遺傳定律的基因座為突變。

2. 結果

2.1常染色體D12S391基因座分型與頻率

1000 例河南漢族無關個體在D12S391基因座共檢測到16個等位基因。其中最常見的等位基因為 19（2135），最少見的等位基因有18.2、18.3、27。各等位基因及基因頻率，見表 1

2.2 D12S391基因座分型結果

親子鑒定案件運用GoldenEye_20A熒光系統(tǒng)檢測20個基因座分型結果是否符合遺傳規(guī)律。進一步采用EX22熒光檢測試劑盒檢測22個基因座進行復核驗證突變的STR位點，發(fā)現(xiàn)基因座的分型與上述結果一致，其余均符合遺傳規(guī)律（圖1）。采用AGCU 21+1試劑盒進一步檢測，共檢測 21個STR基因座，其中D19S433為重復基因座，新增的20個多態(tài)性STR基因座均符合遺傳規(guī)律。

2.3 D12S391基因座突變分析

根據(jù)人類遺傳規(guī)律，孩子的遺傳基因必然來自親生父母雙方。本案例D12S391基因座的突變來源于父親。在發(fā)現(xiàn)的69例突變中不同等位基因突變的概率見表2。

3. 討論

STR基因座突變與遺傳多態(tài)性程度有著一定的關系，對其發(fā)生突變機制的共識是DNA 復制滑動（replication slippage）[7]。表現(xiàn)為STR基因座等位基因重復單位的減少或增加，從而使新合成的DNA鏈減少或增加一至多個基序，對應則被稱為一步突變或多步突變[8-9]。擴增片段較大的STR基因座更容易發(fā)生突變，這可能是由于重復單位多的基因座其長度也較長，必然多態(tài)性程度也較高，其突變概率會隨之增加[10]。

司法鑒定技術規(guī)范要求累計親權指 數(shù)大于10000時支持被檢測男子（或被檢測女子）是孩子生物學父親（或母親），累計親權指數(shù)小于 0.0001支持被檢測男子（或被檢測女子）不是孩子生物學父親（或母親）[11]。所謂的突變均是建立于在認定親權關系的假設上。如果只有 1～2 個基因座不符合遺傳規(guī)律，累計親權指數(shù)在0.0001～10000之間應增加檢測其他高度多態(tài)性且遺傳穩(wěn)定的STR基因座，以避免由于STR基因座突變導致錯誤地排除親權關系[12]。

STR 基因座突變存在性別差異，通常男性突變生概率高于女性[13]。本研究結果顯示，突變來源有明顯性別差異，父源突變與母源突變的比例為9：1，這與文獻報道一致[14]。本研究1000例案例中D12S391基因座突變有69例，均為1步突變。隨著二代測序技術的發(fā)展，在實驗室條件允許的情況下，還可以進行二代測序，新一代測序應用于法醫(yī) DNA分析的有很大的優(yōu)勢。它能夠分辨長度相同、但堿基序列不同的等位基因。通過檢測突變位點的堿基序列，從而判斷其變異的真實性。

因此，我們在進行親子鑒定時， 運用多種該技術手段進行驗證，提高準確率，并選用突變率低、多態(tài)信息含量相對較高的STR位點。在進行個體識別時，可選用突變率高的STR 位點如D12S391， 這樣會減少在分析結果時碰到困難的機會。

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河南省生殖健康科學技術研究院 河事緣法醫(yī)物證司法鑒定所 河南鄭州?450003