杜燕燕，曾琳玲，彭學強，伍嘉艷，劉 鑒

［1.中山市中醫(yī)院麻醉科，廣東中山 528400；2.廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）心外麻醉科，廣州510080］

異丙酚是一種短效靜脈麻醉劑［1-2］，能保護腦缺血/再灌注損傷后的大腦和脊髓［3］，在臨床麻醉中得到了廣泛的應用。靜脈注射異丙酚后可導致心肌β腎上腺素受體密度降低［4-5］。心肌鈣通道在缺血后的異常功能是導致鈣離子流入的因素，異丙酚可防止大量鈣質(zhì)在細胞內(nèi)積聚而引起的心臟驟停，還會影響興奮收縮耦合，造成負向性效應。交感神經(jīng)-腎上腺素系統(tǒng)的變化在充血性心力衰竭（CHF）中最為重要［6-7］，交感神經(jīng)張力的變化可通過腎上腺素受體介導的生物學效應直接影響充血性心力衰竭的進程［8］。人心肌β腎上腺素受體分為β1、β2、β3 亞型，目前對β1與β2 受體的研究較多［9］。β受體阻斷藥可以減輕心力衰竭患者的癥狀，逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，但并不對所有心力衰竭患者均有效。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）是Ca2+敏感信號物質(zhì)［10-11］，能在心臟肥厚的發(fā)生過程中起重要作用，揭示出一種新的信號傳導途徑，即CaN途徑。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2017 年6 月至2018 年12 月在中山市中醫(yī)院篩選65～75 歲的二尖瓣置換患者46例作為研究對象，共分成2 組，即對照組（n=23）和異丙酚組（n=23）?；颊吣挲g65～75 歲，體質(zhì)量指數(shù)為18～30 kg/m2；無對異丙酚過敏史。入選標準：擬行二尖瓣置換術的患者；患者年齡65～75 歲，術后接受常規(guī)治療。排除標準：肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒感染的患者；自身免疫性疾病患者；惡性腫瘤患者；嚴重的心腦血管等疾病患者；肝及腎功能不全患者。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，且受試者均已簽署書面知情同意書。

1.2 試驗方法

1.2.1 異丙酚靜脈注射 術前，所有患者嚴禁飲水飲食，患者進入手術室后監(jiān)測其心電圖、無創(chuàng)血壓、脈搏氧飽和度、腦電圖雙頻指數(shù)（BIS）及插管后監(jiān)測圖末端排出二氧化碳后，異泊酚組患者使用微泵注射異泊酚［2～6 mg/（kg·h）］+靜脈注射右美托咪定0.7 μg/kg，腦電圖雙頻指數(shù)保持在40～60 間。對照組注射等量0.9%氯化鈉溶液+靜脈注射右美托咪定0.7 μg/kg。

1.2.2 左心室功能檢測 分別記錄給藥前與給藥后10、20、30 min 時各組的心率、左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）及左心室內(nèi)壓變化最大速率（±dp/dtmax）。

1.2.3 心肌取材 術中夾取二尖瓣置換術患者切除的少許左心室乳頭肌組織，置于液氮中進行冷凍保存，在3 個月內(nèi)，進行相關的分子生物學試驗和病理檢查。

1.2.4 β1、β2、β3 受體反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應 對心肌組織進行總mRNA 提取。取出在超低溫冰箱中備好的組織，棄除凍存管后轉(zhuǎn)移到經(jīng)液氮預冷過的研缽中，以柞子研磨組織，在此過程中不斷加入液氮，直到研至粉末狀。將研磨好的樣品置于己加入適量試劑的勻漿管中（100 mg 組織中加入1 mL Trizol），將勻漿管置于冰浴中，于組織勻漿粉碎機上勻漿，直至勻漿液不黏并且無顆粒。把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，于室溫孵育5 min后，加入0.2 mL 氯仿，振蕩15 s，室溫孵育10 min后，4℃12 000g離心15 min。收集上層無色水相（約400 μL），置新的1.5 mL EP 離心管中，棄沉淀管。加0.5 mL 異丙醇振蕩混勻，室溫孵育5 min，4 ℃下12 000g離心10 min，棄上清。向管中加入1 mL 保存在4 ℃的75%乙醇（以DEPC 水配制），振蕩混勻，4 ℃下10 000g離心5 min，舍棄上清。在空氣中干燥5～10 min，在冰上加20 μL DEPC 水溶解RNA，-80 ℃冰箱保存。通過瓊脂糖電泳檢測RNA 含量。以全自動紫外分光光度計檢測OD值，進而判斷RNA 的純度及濃度，并進行定量。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑說明書配制反轉(zhuǎn)錄反應體系，在冰上操作，最終在聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀上自動完成。將合成的cDNA 置于-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄反應體系（20 μL）如表1 所示，反應條件如表2 所示進行實時熒光定量PCR。使用北京全式金生物技術公司合成下列相關引物，模板為cDNA，內(nèi)參為β-actin。對應基因引物序列如表3 所示。

表1 cDNA 反轉(zhuǎn)錄體系

表2 實時熒光定量PCR 反應條件

表3 引物的核苷酸序列

1.2.6 Western blot 測定蛋白表達量 通過Western blot 試驗檢測CaN、活化T 細胞核因子3（nuclear factor of activated T-cells 3，NFAT3）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（zinc finger transcription factor gata 4，GATA4）的表達量。取0.1 g 心肌組織，加500 μL 蛋白裂解液［RIPA，臨用前加入苯甲基磺酰氟（PMSF）及磷酸酶抑制劑］，在冰浴下震蕩0.5 h，將液體移至1.5 mL離心管中，在4℃冷凍離心機中12 000 r/min 離心20 min，取上清，利用BCA 蛋白法對蛋白濃度進行測定，加入適量上樣緩沖液，100℃水浴加熱5 min，以使蛋白變性，8 000 r/min 離心5 min 后上樣，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠電泳進行分析，上樣量為20～40 μL/孔，分別進行轉(zhuǎn)膜與雜交。

1.3 統(tǒng)計學分析

本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件（美國IBM 公司）進行處理。計量資料采用（）表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料采用［n（%）］表示，組間比較采用χ2分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者給藥前后不同時間點心率比較

對照組手術前后心率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；異丙酚組患者靜脈注射異泊酚后心率比對照組患者低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；異丙酚組患者給藥后10、20、30 min 的心率比給藥前低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 兩組患者給藥前后不同時間點心率比較［n=23，次/min，］

表4 兩組患者給藥前后不同時間點心率比較［n=23，次/min，］

2.2 兩組患者給藥前后不同時間點左心室收縮壓比較

對照組手術前后LVSP 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；異丙酚組患者靜脈注射異泊酚后LVSP 比對照組患者低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；異丙酚組患者給藥后10、20、30 min 的LVSP比給藥前低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 兩組患者給藥前后不同時間點LVSP 比較［n=23，mmHg，］

表5 兩組患者給藥前后不同時間點LVSP 比較［n=23，mmHg，］

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.3 兩組患者給藥前后不同時間點左心室內(nèi)壓變化率比較

對照組手術前后左心室內(nèi)壓變化率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；異丙酚組患者靜脈注射異泊酚后左心室內(nèi)壓變化率比對照組患者低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；異丙酚組患者給藥后10、20、30 min 的左心室內(nèi)壓變化率比給藥前低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表6。

表6 兩組患者給藥前后不同時間點左心室內(nèi)壓變化率比較 ［n=23，%，］

表6 兩組患者給藥前后不同時間點左心室內(nèi)壓變化率比較 ［n=23，%，］

2.4 兩組患者心肌病理圖片比較

心肌組織蘇木素伊紅染色光學顯微鏡結(jié)果顯示，對照組患者的心肌纖維排列整齊，有明確的水平線；異丙酚組患者的心肌纖維無序，橫向面肌肌絲大小不同，有些心肌細胞肥大，細胞質(zhì)液泡變性，尤其在細胞核周圍，肌絲?；蚓W(wǎng)狀化，間質(zhì)擴大，如圖1 所示。

圖1 兩組患者心肌組織光學顯微鏡下圖片比較（蘇木素伊紅染色，×400）

2.5 兩組患者反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應結(jié)果比較

與對照組患者相比，異丙酚組患者的β1 受體mRNA 表達減少、β3 受體mRNA 表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；β2 受體mRNA 表達無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表7。

表7 兩組患者心肌組織β1、β2、β3 受體mRNA 表達結(jié)果比較 ［n=23，］

表7 兩組患者心肌組織β1、β2、β3 受體mRNA 表達結(jié)果比較 ［n=23，］

2.6 兩組患者心肌組織Western blot檢查結(jié)果比較

與對照組患者相比，異丙酚組患者的NFAT3、GATA 表達量增加，CaN、GATA 4 磷酸化水平增加，NFAT3 磷酸化水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表8 和圖2。

圖2 兩組患者心肌組織Western blot 測定條帶比較

表8 兩組患者心肌組織Western blot 檢查結(jié)果比較 ［n=23，］

表8 兩組患者心肌組織Western blot 檢查結(jié)果比較 ［n=23，］

3 討論

研究指出，異泊酚廣泛用于麻醉的誘導和維持［12-13］，單次給藥誘導時多在血壓、心率、心室功能等方面出現(xiàn)不同程度的抑制。本研究在異泊酚給藥后，分別對患者心率、心室功能等進行研究發(fā)現(xiàn)，對照組手術前后心率、LVSP、左心室內(nèi)壓變化率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；異丙酚組患者靜脈注射異泊酚后心率、LVSP、左心室內(nèi)壓變化率比對照組患者低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；異丙酚組患者給藥后10、20、30 min 的心率、LVSP、左心室內(nèi)壓變化率比給藥前低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。心肌組織蘇木素伊紅染色光學顯微鏡結(jié)果顯示，對照組患者的心肌纖維排列整齊，有明確的水平線；異丙酚組患者的心肌纖維無序，橫向面肌肌絲大小不同，有些心肌細胞肥大，細胞質(zhì)液泡變性，尤其在細胞核周圍，肌絲?；蚓W(wǎng)狀化，間質(zhì)擴大［14-15］。

β腎上腺素受體表達的變化與心肌信號通路的調(diào)節(jié)有關。在充血性心力衰竭研究中發(fā)現(xiàn)，隨著充血性心力衰竭嚴重程度的升高，三種β受體亞型的表達呈現(xiàn)出不同的趨勢，充血性心力衰竭嚴重程度越大，β1 受體的表達越多［16］，β2 受體的表達與充血性心力衰竭嚴重程度相關性不大，β3受體基因的表達與心臟功能障礙有密切關系，其中充血性心力衰竭、β心肌受體呈下降趨勢［17-18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異丙酚組患者β1 受體mRNA 表達減少，β2 受體mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義，β3 受體mRNA 表達增加。與對照組患者相比，異丙酚組患者的NFAT3、GATA 表達量增加，CaN、GATA 4 磷酸化水平增加，NFAT3 磷酸化水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。異丙酚靜脈注射降低老年患者左心室功能，降低β1 受體mRNA 的表達，促進β3 受體mRNA 表達，對β2 受體mRNA表達無顯著影響。β3 受體主要分布于白色及棕色脂肪組織，調(diào)節(jié)能量代謝，也介導心臟負性肌力及血管平滑肌舒張作用。本研究結(jié)果提示β3 受體表達增加可能是異丙酚靜脈注射降低老年患者左心室功能的關鍵原因。

CaN 作為細胞內(nèi)的Ca2+信號物質(zhì)［19-20］，在心肌肥大中起著重要作用，有報道指出，在心肌肥大中有一種新的信號轉(zhuǎn)導途徑，即CaN-NFAT3（活化T 細胞因子）信號轉(zhuǎn)導途徑［21-22］。這項研究表明，心肌細胞在心肌肥大因子如血管緊張素的刺激下，可以通過增加Ca2+濃度，激活的CaN 使NFAT3去磷酸化并進入細胞核。入核后的去磷酸化NFAT3與轉(zhuǎn)錄因子GATA4 相互作用，對多種心肌肥厚的相關基因具有活化作用［23］，β1 受體表達減少與β3 受體表達的增加參與了CaN 信號通路的激活，調(diào)節(jié)充血性心力衰竭患者心肌重構(gòu)的病理過程。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組患者相比，異丙酚組患者的NFAT3、GATA 表達量增加，CaN、GATA 4磷酸化水平增加，NFAT3 磷酸化水平降低。

綜上所述，異丙酚靜脈注射降低老年患者左心室功能，降低β1 受體mRNA 的表達，促進β3 受體mRNA 表達，對β2 受體mRNA 表達無顯著影響。