劉暢 潘婕 劉雄偉 丁晶鑫 周英

摘 要： 為探究苗藥八爪金龍群體遺傳進(jìn)化和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，該研究利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)（SLAF-seq）對(duì)42份八爪金龍樣品進(jìn)行測(cè)序，獲得多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽。同時(shí)采用GATK 和SAMtools軟件在多態(tài)性SLAF中檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）分子標(biāo)記，并利用SNP分子標(biāo)記分析八爪金龍樣品間的遺傳分化關(guān)系。結(jié)果表明：（1）42份八爪金龍共獲得246.35 Mb reads，測(cè)序質(zhì)量值Q30 的平均值為95.66%，GC 含量的平均值為41.14%。（2）通過(guò)生物信息學(xué)的分析，獲得1 769 265個(gè)SLAF 標(biāo)簽，其中379 829個(gè)多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽，共開(kāi)發(fā)2 299 640個(gè)SNPs分子標(biāo)記。（3）利用開(kāi)發(fā)的SNPs數(shù)據(jù)構(gòu)建八爪金龍的系統(tǒng)發(fā)育樹， 42份八爪金龍分成兩個(gè)大的類群。第一類群為細(xì)柄百兩和原變種百兩金;第二類群由貴州朱砂根、紅涼傘、湖北朱砂根和江西朱砂根組成。江西朱砂根與其余群體關(guān)系較遠(yuǎn)，有明顯的分群現(xiàn)象。該研究從基因組水平揭示不同地區(qū)八爪金龍資源之間的遺傳關(guān)系，為八爪金龍種質(zhì)資源的鑒定和遺傳多樣性分析提供了理論基礎(chǔ)，所開(kāi)發(fā)的SNP 位點(diǎn)可進(jìn)一步用于挖掘與品質(zhì)、抗逆性等相關(guān)的基因。

關(guān)鍵詞： 八爪金龍， SLAF-seq， SNP， 遺傳進(jìn)化， 親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)： Q943 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號(hào)： 1000-3142（2021）07-1145-10

Abstract： In order to explore the genetic evolution and relationship in Radix Ardisia， the 42 materials were used to sequencing base on specific loci amplified fragment sequencing （SLAF-seq）. Based on polymorphic SLAF tags， single nucleotide polymorphisms （SNPs） were identified by the GATK and SAMtools softwares， and to analysis the genetic differentiation. The results were as follows： （1） A total of 246.35 Mb reads data were obtained by SLAF-seq， the average of Q30 and GC content was 95.66% and 41.14%， respectively. （2） In total， 1 769 265 high quality SLAF tags were obtained， including 379 829 polymorphic SLAF tags， and a total of 2 299 640 SNPs were obtained. （3）Through the SNPs data， Radix Ardisia were divided into two groups. The first group contained BLX1-8 and BLY1-8， the second group contained ZSG1-8， HL， ZSH1-6 and ZSJ1-6. The results revealed the genetic relationships in the genomic level and provided theoretical basis for germplasm identification and genetic diversity analysis of Radix Ardisia and developed SNPs could be further used for excavating the gene related resistant， quality and so on.

Key words： Radix Ardisia， SLAF-seq， SNP， genetic evolution， genetic relationship

八爪金龍為貴州省苗族常用藥物，其藥用部位為根及根莖，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、散瘀止痛等功能，被苗族奉為喉科良藥，是苗藥驗(yàn)方開(kāi)喉劍噴霧劑（趙歐等，2016）和養(yǎng)陰口香合劑（吳筑華，2012）的主要成分。八爪金龍藥材來(lái)源多樣，其基原植物為紫金?？疲∕yrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia）植物朱砂根（A. crenata）、紅涼傘（A. crenata var. bicolor）、百兩金（A. crispa）、大葉百兩金（A. crispa var. amplifolia）和細(xì)柄百兩金（A. crispa var. dielsii） （中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)， 2002）。研究表明，不同來(lái)源的八爪金龍藥材化學(xué)成分存在差異，其主要成分巖白菜素的含量在不同來(lái)源的八爪金龍中存在差異，朱砂根中的皂苷數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)豐富于百兩金（Liu et al.， 2016）;而百兩金中發(fā)現(xiàn)的4種黃酮類在朱砂根未被鑒定到（黃偉等，2010）?；瘜W(xué)成分的形成與品質(zhì)、產(chǎn)地、生態(tài)等密切相關(guān)，而化學(xué)成分決定其質(zhì)量的好壞及其藥理作用。

八爪金龍資源主要以野生為主，其地理分布、生態(tài)環(huán)境、生長(zhǎng)周期、采收與產(chǎn)地初加工存在的差異，為八爪金龍用藥準(zhǔn)確及質(zhì)量均一帶來(lái)了難題;其藥材使用比較混亂，也使得質(zhì)量難以控制，嚴(yán)重影響其質(zhì)量控制以及臨床使用的“療效同等性”。因此，建立有效的鑒定方法，對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，明確八爪金龍的起源和親緣關(guān)系，優(yōu)選出質(zhì)量較好且穩(wěn)定的居群，保證其正確使用，對(duì)于規(guī)范八爪金龍流通和臨床有效利用具有重要的指導(dǎo)意義。目前主要的鑒別方法有性狀鑒別、顯微鑒別、DNA條形碼等（陳新蓮等，2017;陳文婷等，2020;潘婕等，2020），但這些方法具有片面性強(qiáng)或?qū)嶒?yàn)過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)。高通量測(cè)序的技術(shù)，如簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（SLAF-seq）已經(jīng)被運(yùn)用于藥用植物的種質(zhì)資源鑒定、遺傳定位分析、多態(tài)性分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析等（Liu et al.， 2016;Du et al.， 2019）。

本研究利用SLAF-seq技術(shù)對(duì)貴州、湖北、江西3個(gè)地點(diǎn)的42份八爪金龍種質(zhì)資源進(jìn)行測(cè)序，獲得SLAF多態(tài)性標(biāo)簽，應(yīng)用GATK 和SAMtools軟件對(duì)SNP 進(jìn)行檢測(cè)?；赟NP分子標(biāo)記，利用生物信息學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹、群體結(jié)構(gòu)和PCA分析，從基因組水平揭示不同個(gè)體之間的遺傳分化關(guān)系，評(píng)估八爪金龍遺傳資源的親緣關(guān)系，為八爪金龍種質(zhì)資源的鑒定和育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

42份八爪金龍種質(zhì)資源來(lái)源于貴州、湖北和江西，其中貴州30份（8份原變種百兩金B(yǎng)LY、8份細(xì)柄百兩金B(yǎng)LX、8份朱砂根ZSG、6份紅涼傘HL），湖北恩施朱砂根ZSH 6份，江西武功山朱砂根ZSJ 6份，對(duì)葉片形態(tài)進(jìn)行拍照觀察。具體分布地點(diǎn)如表1所示。

1.2 基因組DNA 的制備

取約40 mg八爪金龍葉片，用75%醫(yī)用酒精棉球擦拭葉片，將其剪碎后，加入液氮研磨，利用試劑盒提取八爪金龍基因組總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測(cè)八爪金龍基因組DNA的質(zhì)量和濃度。

1.3 Illumina HiSeq 測(cè)序及產(chǎn)出數(shù)據(jù)的質(zhì)量分析

由于八爪金龍目前尚無(wú)基因組序列信息發(fā)布，同時(shí)也無(wú)其近緣物種的基因組作參考，根據(jù)八爪金龍基因組的大小以及GC 含量等信息。選取水稻日本晴（Oryza sativa ssp. japonica）參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測(cè)，選擇最適酶切方案，以期獲得足夠標(biāo)簽數(shù)的酶切片段（SLAF標(biāo)簽）（Davey et al.， 2013）。選取HaeIII+ScaI-HF酶進(jìn)行酶切，對(duì)質(zhì)量合格的八爪金龍個(gè)體基因DNA 分別進(jìn)行酶切。將酶切片段的3′端加A，加 Dual-index接頭（Kozich et al.， 2013），然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、建庫(kù)，質(zhì)檢合格的文庫(kù)，利用Illumina HiSeq 進(jìn)行測(cè)序。

1.4 SLAF 標(biāo)簽和SNP 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

利用Dual-index識(shí)別測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)，獲得樣品的reads，對(duì)低質(zhì)量的reads及read接頭進(jìn)行過(guò)濾，獲得高質(zhì)量的reads。對(duì)高質(zhì)量的reads進(jìn)行聚類分析，聚在一起的為同一個(gè)SLAF 標(biāo)簽，其不同個(gè)體間序列的差異為多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽。以測(cè)序深度最高的SLAF標(biāo)簽序列作為參考序列，利用BWA軟件（Li et al.， 2009）將高質(zhì)量的reads比對(duì)到參考基因組上，結(jié)合GATK（McKenna et al.， 2010）和SAMtools（Li et al.， 2009）軟件計(jì)算SNP分子標(biāo)記，取兩個(gè)軟件的交集得到最終的SNP分子標(biāo)記，MAF>0.05的SNP被認(rèn)為是代表性的SNP。

1.5 遺傳結(jié)構(gòu)分析

將具有代表性的高質(zhì)量SNP使用MEGA X（Kumar et al.， 2018）軟件，基于鄰接法（neighbor-joining），采用Kimura 2-parameter模型，bootstrap重復(fù)1 000次，構(gòu)建各樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹?；赟NP數(shù)據(jù)，利用admixture軟件（Alexander et al.， 2009），分析樣品的群體結(jié)構(gòu)，假設(shè)樣品的分群數(shù)（K值）為1～10，進(jìn)行聚類分析，利用交叉驗(yàn)證法驗(yàn)證聚類結(jié)果，交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率最小時(shí)為最佳分群數(shù)。同時(shí)利用EIGENSOFT軟件（Price et al.， 2006），進(jìn)行主成分分析（principal components analysis）（PCA），得到樣品的主成分聚類情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 八爪金龍的形態(tài)特征

苗藥八爪金龍由朱砂根、紅涼傘、百兩金和細(xì)柄百兩金等的根莖加工而成。朱砂根（ZS）、紅涼傘（HL）、原變種百兩金（BLY）及細(xì)柄百兩金（BLX）在葉片形態(tài)上存在差異，細(xì)柄百兩金葉片較狹窄，朱砂根的葉片邊緣有齒，紅涼傘葉片背面是紅色的（圖1）。百兩金及其變種主要區(qū)別在于葉片長(zhǎng)度及寬度。朱砂根變種紅涼傘的葉背、花梗、花萼及花瓣均帶紫紅色（圖1）。

2.2 建庫(kù)評(píng)估

利用SLAF-predict 軟件對(duì)八爪金龍基因組進(jìn)行酶切方案預(yù)測(cè)，選擇HaeⅢ+ScaI-HF酶對(duì)八爪金龍基因組進(jìn)行酶切，SLAF 標(biāo)簽長(zhǎng)度為414～464 bp，預(yù)測(cè)得到222 509個(gè)SLAF 標(biāo)簽（表2）。將水稻日本晴的測(cè)序reads與其參考基因組進(jìn)行比對(duì)，水稻日本晴雙端比對(duì)率為96.96%，酶切比例為95.79%（表3）。

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評(píng)估

經(jīng)Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，共獲得246.35 Mb reads，測(cè)序后各樣品的reads數(shù)目在1 491 644～11 923 328 bp 范圍內(nèi)（圖2）。測(cè)序質(zhì)量值Q30平均值為95.66%，測(cè)序堿基錯(cuò)誤率低，所獲數(shù)據(jù)合格;測(cè)序獲得GC 含量平均值為41.14%，達(dá)到測(cè)序要求。

2.4 SLAF 標(biāo)簽與SNP 標(biāo)記的鑒定

通過(guò)序列分析，從42份八爪金龍中共獲得了1 769 265 個(gè)SLAF 標(biāo)簽（表4）。標(biāo)簽的平均測(cè)序深度為26.48，鑒定到379 829個(gè)多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，對(duì)多態(tài)性SLAF標(biāo)簽進(jìn)行分析，共開(kāi)發(fā)得到2 299 640個(gè)SNP 位點(diǎn)（表4）。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于開(kāi)發(fā)的2 299 640個(gè)SNP，采用 Kimura 2-parameter 模型，構(gòu)建所有個(gè)體的 NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。42份樣品可分成2 個(gè)大的類群，第一類群由細(xì)柄百兩金（BLX1-8）和原變種百兩金（BLY1-8），顯示它們之間有更近的親緣關(guān)系，細(xì)柄百兩金可能由原變種百兩金上溯而來(lái)。第二類群由貴州朱砂根（ZSG1-8）、紅涼傘（HL）、湖北朱砂根（ZSH1-6）和江西朱砂根（ZSJ1-6）組成，表明它們之間有較近的親緣，其分化有著明顯的地域特征。

2.6 遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于開(kāi)發(fā)出的2 299 640個(gè)SNP 位點(diǎn)，通過(guò)admixture軟件分析群體結(jié)構(gòu)。K 值為 1～10 的聚類情況（圖4）及各個(gè) K 值對(duì)應(yīng)的交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率（圖 5），交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率最小時(shí)為最優(yōu)分群組。當(dāng) K=6時(shí)，交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率最小，因此最佳分群數(shù)為6，將42 份八爪金龍種質(zhì)資源分為6個(gè)亞組，表明八爪金龍種間遺傳差異較大，形成明顯的種群遺傳分化。當(dāng)K=2時(shí)，百兩金和朱砂根明顯分開(kāi);當(dāng)K=3時(shí)，朱砂根、百兩金和江西武功山朱砂根區(qū)分開(kāi);當(dāng)K=4時(shí)，將細(xì)柄百兩金、原變種百兩金、江西武功山朱砂根和貴州朱砂根區(qū)分開(kāi);當(dāng)K=5時(shí)，將細(xì)柄百兩金、原變種百兩金、江西武功山朱砂根、貴州朱砂根和湖北朱砂根區(qū)分開(kāi);當(dāng)K=6時(shí)，將細(xì)柄百兩金、原變種百兩金、江西武功山朱砂根、貴州朱砂根、湖北朱砂根區(qū)分開(kāi)和紅涼傘區(qū)分開(kāi)，但存在基因滲入的情況。

2.7 PCA分析

用EIGENSOFT軟件對(duì)2 299 640個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCA分析，得到42份八爪金龍主成分聚類分析結(jié)果（圖6）。通過(guò)PCA 分析將個(gè)體聚為三維，PC1 代表第一主成分，PC2 代表第二主成分，PC3 代表第三主成分，且 PC1、PC2、PC3 的方差貢獻(xiàn)率分別為39.21%、18.58%、7.71%。從圖6可以看出，樣品間存在差異，來(lái)自同一地方的朱砂根/百兩金基本上聚在一起，說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系比較近。圖中不同顏色表示所屬的群體，能夠反映個(gè)體的聚類情況，群體之間的距離能夠反映親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。群體之間的距離越遠(yuǎn)說(shuō)明遺傳背景越遠(yuǎn)，將 42 份材料大致分為 A、B、C、D 四組。A 組為原變種百兩金（除BLY1外）;B 組為細(xì)柄百兩金（除BLX5、BLX6、BLX8外）;C組為貴州朱砂根（ZSG1-8）、湖北朱砂根（ZSH）和紅涼傘（HL），說(shuō)明這三個(gè)種或變種的遺傳背景差異較小;D 組為江西朱砂根（ZSJ1-6），與其余群體關(guān)系較遠(yuǎn)，有明顯的分群現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

近幾年，RAPD、ISSR 等分子標(biāo)記已應(yīng)用到八爪金龍種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)和遺傳分析，采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)朱砂根遺傳多樣性進(jìn)行分析，朱砂根群體在DNA 水平上存在著豐富的遺傳多態(tài)性（江香梅等，2006）。駱亮等（2020）分析了20個(gè)朱砂根野生居群的255個(gè)樣品的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)5條ISSR 引物共擴(kuò)增出96條多態(tài)性條帶。但由于八爪金龍無(wú)參考基因組，常規(guī)方法開(kāi)發(fā)的特異分子標(biāo)記數(shù)量不多。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是一種較為有效的分子標(biāo)記（Liu et al.， 2012），可用于動(dòng)植物的群體遺傳和進(jìn)化關(guān)系研究。趙俊生等（2016）利用SNP分子標(biāo)記分析化橘紅的種質(zhì)資源，從中篩選出21個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)，為化橘紅種質(zhì)資源鑒定提供了有效的分子標(biāo)記。孫清明等（2013）利用SNP分子標(biāo)記對(duì)363份荔枝種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，為荔枝新種質(zhì)的親本來(lái)源鑒定提供分子標(biāo)記。

簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（SLAF-seq ）技術(shù)能夠在無(wú)參基因組物種中實(shí)現(xiàn)SNP特異性分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)，可用于植物遺傳多樣性的研究。有研究利用SLAF-seq 技術(shù)已經(jīng)構(gòu)建了枸杞果實(shí)和葉片性狀的SNP高密度遺傳圖譜（Zhao et al.， 2019）和丹參高密度遺傳連鎖圖（Liu et al.， 2016）。Du et al.（2019）采用SLAF-seq方法，對(duì)7個(gè)中國(guó)本地山楂屬植物和2個(gè)歐洲、1個(gè)北美外來(lái)山楂屬植物的53個(gè)家系進(jìn)行了分析，共鑒定出933 450個(gè)SNP，用于物種基因組進(jìn)化研究。姜濤等（2020）利用SLAF-seq測(cè)序技術(shù)對(duì)39份連翹種質(zhì)資源遺傳多樣性和SNP分子標(biāo)記進(jìn)行研究，共獲得180 974 1個(gè)SNP分子標(biāo)記，將連翹資源分為4組，為其遺傳結(jié)構(gòu)分類提供新的信息。唐曉敏等（2020）利用SLAF-seq 技術(shù)對(duì)廣金錢草樣品進(jìn)行測(cè)序，開(kāi)發(fā)得到SNP多態(tài)標(biāo)記220 704個(gè)，為種質(zhì)保護(hù)和遺傳改良提供參考。本研究利用SLAF-seq 技術(shù)對(duì)42份八爪金龍種質(zhì)資源進(jìn)行測(cè)序，共開(kāi)發(fā)得到2 299 640個(gè)SNP位點(diǎn)，為后期八爪金龍?zhí)禺愋許NP開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)，同時(shí)為八爪金龍遺傳育種改良，提高育種效率提供數(shù)據(jù)參考。

植物的生長(zhǎng)環(huán)境、地理位置、海拔高度對(duì)物種的遺傳分化和種群結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生影響。地理分布和海拔高度的差異影響浙江產(chǎn)車前草種群的遺傳分化（郭水良等，2002）。不同地理位置的廣金錢草種源間存在一定的遺傳分化（唐曉敏等，2020）。系統(tǒng)發(fā)育樹主要是描述物種之間的分類學(xué)和進(jìn)化關(guān)系以及具有共同祖先的物種之間的進(jìn)化關(guān)系的樹形圖（韓鳳俠等，2008）。本研究構(gòu)建了42份八爪金龍樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹可以將百兩金和朱砂根區(qū)分開(kāi)。課題組前期對(duì)八爪金龍基原植物DNA 條型碼進(jìn)行篩選，ITS 序列能區(qū)別百兩金和朱砂根，但無(wú)法區(qū)分朱砂根和紅涼傘（潘婕等，2020）。因此，百兩金和朱砂根親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，化學(xué)成分存在差異，需進(jìn)一步明確其藥理作用的差異，保證其正確使用。

葉片形態(tài)表明，貴州朱砂根和湖北恩施州朱砂根葉片形態(tài)相近，而與江西武功山朱砂根葉片形態(tài)差距較大。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，貴州朱砂根和湖北恩施州朱砂根親緣關(guān)系較近，與江西武功山朱砂根關(guān)系較遠(yuǎn);紅涼傘與貴州的朱砂根和湖北恩施州的朱砂根親緣關(guān)系較近。貴州和湖北恩施州同屬苗族聚集區(qū)，江西武功山與貴州和湖北恩施州在人為環(huán)境和地理環(huán)境方面存在差異。因此，江西武功山朱砂根種源在進(jìn)化過(guò)程中受到了人文環(huán)境、地理環(huán)境隔離的影響，與貴州、湖北恩施州的朱砂根種源基因交流較少，逐漸出現(xiàn)分化。

朱砂根和紅涼傘葉片形態(tài)相近，但紅涼傘的葉背、花梗、花萼及花瓣均帶紫紅色，DNA條形碼無(wú)法區(qū)分朱砂根和紅涼傘（陳新蓮等，2017;潘婕等，2020）。當(dāng)K=6 時(shí)的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，將細(xì)柄百兩金、原變種百兩金、江西武功山朱砂根、貴州朱砂根、湖北朱砂根和紅涼傘區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明八爪金龍種源間存在一定的遺傳分化?；赟NP的分子標(biāo)記，能夠區(qū)分紅涼傘和朱砂根，因此，我們將進(jìn)一步開(kāi)發(fā)紅涼傘和朱砂根特異的SNP分子標(biāo)記。

基于SNP 標(biāo)記構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹為研究八爪金龍品種之間親緣關(guān)系提供了證據(jù)，雖然八爪金龍野生種可能具有相似的起源種，但在演化過(guò)程中逐漸出現(xiàn)分化;同時(shí)本研究開(kāi)發(fā)的SNP 位點(diǎn)為后續(xù)八爪金龍品種間共有或特異性標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)，理清歸納八爪金龍品種間生物學(xué)特征。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）