檸檬香茅資源的抗寒性評(píng)價(jià)與篩選

李海明 吳水金 黃惠明 李躍森 鄭開斌

摘要：以4個(gè)檸檬香茅資源（漳州香茅、廣東香茅、永春香茅、新西蘭香茅）的葉片作為材料，進(jìn)行-25、-15、0、5、15 ℃低溫處理，測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性及POD活性，計(jì)算半致死溫度（LT50），并應(yīng)用隸屬函數(shù)法對(duì)各生理指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)判。結(jié)果表明，隨著處理溫度的降低，4個(gè)檸檬香茅資源的相對(duì)電導(dǎo)率呈逐漸升高的趨勢(shì)，半致死溫度為-21.81～-20.94 ℃。低溫脅迫過程中，各香茅品種的SOD、POD活性整體呈升高的趨勢(shì);MDA含量隨著處理溫度的降低逐漸升高。采用隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)的4個(gè)香茅資源的抗寒性，其由強(qiáng)到弱依次為漳州香茅>永春香茅>新西蘭香茅>廣東香茅。通過抗寒性評(píng)價(jià)可知，漳州香茅、永春香茅可向低溫地區(qū)引種或作為抗寒育種材料。

關(guān)鍵詞：檸檬香茅;抗寒性;生理生化指標(biāo);隸屬函數(shù)法

中圖分類號(hào)： S573+.401 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）14-0123-04

香茅是禾本科香茅屬約55 種芳香性植物的統(tǒng)稱，亦稱為香茅草，為常見的香草之一[1]，其中檸檬香茅（Cymbopogon citratus）又稱檸檬草，葉有很濃的檸檬味，原產(chǎn)于東南亞熱帶地區(qū)，我國(guó)廣東、廣西、云南、福建、海南和臺(tái)灣等省均有栽培，喜高溫多濕氣候，在無霜或少霜害地區(qū)生長(zhǎng)良好，由于根系發(fā)達(dá)，能耐旱、耐瘠，生長(zhǎng)比較粗放，不論砂土、黏土還是其他瘠瘦的土壤均可生長(zhǎng)[2-3]。溫度條件是植物正常生長(zhǎng)的重要環(huán)境因素，因此低溫會(huì)限制植物分布，是引種環(huán)節(jié)需要考慮的環(huán)境因素之一[4]。目前香茅屬植物的研究集中在提取工藝、精油成分、抑菌作用及成分分析上[5-8]，抗寒性方面的研究相對(duì)較少。在低溫脅迫下，植物體內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化能夠科學(xué)、準(zhǔn)確地鑒定出植物抗寒性，是植物體內(nèi)一系列生理生化過程綜合作用的結(jié)果，受外界環(huán)境因子的影響或制約[9];相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛 （malondialdehyde，MDA）含量隨著溫度的降低而上升[10-11]，溫度越低，增幅越大;植物體內(nèi)抗氧化酶活性減弱[12]，這些生理生化指標(biāo)的變化，對(duì)植物引種和栽培具有一定的指導(dǎo)意義。本研究對(duì)4個(gè)檸檬香茅資源進(jìn)行不同低溫處理，測(cè)定其各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，以期為檸檬香茅資源的引種，尤其是向低溫地區(qū)引種，提供理論參考依據(jù)。植物在低溫脅迫下，體內(nèi)會(huì)發(fā)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，低溫下細(xì)胞膜的通透性增加，MDA含量隨著溫度降低而上升，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性隨著溫度降低而增強(qiáng)，已作為評(píng)價(jià)植物抗寒性的生理生化指標(biāo)，對(duì)植物引種和栽培具有指導(dǎo)意義。香茅資源的耐寒性及抗寒性方面的研究未見報(bào)道，因此本研究對(duì)4個(gè)檸檬香茅資源（漳州香茅、廣東香茅、永春香茅、新西蘭香茅）進(jìn)行-25、-15、0、5、15 ℃低溫處理，測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性及POD活性，計(jì)算半致死溫度（LT50），并應(yīng)用隸屬函數(shù)法對(duì)各生理指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)判，篩選出抗寒性強(qiáng)的檸檬香茅資源，以期為檸檬香茅資源向低溫地區(qū)引種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

檸檬香茅資源種植于福建省漳州市龍文區(qū)朝陽(yáng)鎮(zhèn)的福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶農(nóng)業(yè)研究所試驗(yàn)地（117°43′41″E、24°32′57″N）。于2020年7月選擇田間長(zhǎng)勢(shì)良好的檸檬香茅品種資源檸檬香茅、永春香茅、廣東檸檬香茅、新西蘭香茅，分別剪取莖上部葉片，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，葉片用自來水沖洗干凈，再用超純水沖洗3次后濾紙吸干，用濕潤(rùn)的紗布包裹，分別在-25、-15、0、5、15 ℃的溫度下處理24 h，處理后的樣品用于各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2 方法

1.2.1 電導(dǎo)率的測(cè)定 參考鄒琦的方法[13]測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率。將低溫處理后的葉片剪成0.5 cm大小，稱取葉片0.1 g，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，放入干凈的具刻度的玻璃試管中，加入去離子水，浸沒樣品，靜置12 h 后，用 DDS-11A型電導(dǎo)率儀測(cè)定葉片浸提液電導(dǎo)率，記為R1。然后將玻璃試管管蓋旋緊，放入水浴鍋 99 ℃水浴 30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測(cè)定浸提液電導(dǎo)率，記為R2，計(jì)算葉片相對(duì)電導(dǎo)率（REC）=（R1/R2）×100%。

1.2.2 半致死溫度（LT50）的計(jì)算 利用相對(duì)電導(dǎo)率，擬合Logistic方程，能夠確定植物的半致死溫度 （LT50），用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同處理溫度與葉片相對(duì)電導(dǎo)率之間的關(guān)系進(jìn)行非線性回歸分析，用 Logistic方程y=k/（1+ae-bx）來擬合，式中：y為相對(duì)電導(dǎo)率;x為處理溫度;k為細(xì)胞傷害率飽和容量，即y的最大極限值;a、b為方程參數(shù)。為了確定 a、b的值，將方程線性化處理得到ln[（k-y）/y]=lna-bx，令 y1=ln[（k-y ）/y]，轉(zhuǎn)化為細(xì)胞傷害率與處理溫度的直線方程。通過回歸求得 a、b值及決定系數(shù)r2，用曲線的拐點(diǎn)作為香茅半致死溫度，即LT50=-（lna）/b，確定不同香茅品種的抗寒性。

1.2.3 酶液的制備 稱取低溫脅迫處理后的香茅葉片約1.0 g，分別取各處理材料按照質(zhì)量體積比（g/mL）1 ∶ 9的比例加入9.0 mL的0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS）（pH值=7.0），研磨，4 ℃ 條件下 8 000 r/min 離心10 min，取上清液即為待測(cè)酶液。

1.2.4 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 參照鄒琦的方法[13]測(cè)定生理指標(biāo)。SOD活性采用NBT光反應(yīng)還原法測(cè)定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用DPS 3.0與Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和顯著性分析。參照文獻(xiàn)[14-15]的方法計(jì)算抗寒性隸屬函數(shù)值，應(yīng)用隸屬函數(shù)法對(duì)各生理指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)判。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下葉片相對(duì)電導(dǎo)率及半致死溫度測(cè)定

由圖1可知，4個(gè)香茅品種資源在15 ℃時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率相當(dāng)，在62%左右，隨著脅迫溫度的降低，4個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率呈增加的趨勢(shì)，可見檸檬香茅葉片相對(duì)電導(dǎo)率與低溫脅迫溫度呈負(fù)相關(guān)，葉片細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，電導(dǎo)率不斷升高。5 ℃時(shí)，永春香茅的相對(duì)電導(dǎo)率最低，為65.59%，其次是新西蘭香茅，為71.29%;當(dāng)溫度到0 ℃時(shí)，漳州本地香茅的相對(duì)電導(dǎo)率最低，為84.40%，其余3個(gè)品種相當(dāng);當(dāng)溫度脅迫到-25 ℃，4個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率相當(dāng)。

從Logistic方程和擬合的結(jié)果（表1）來看，低溫脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率與溫度之間的關(guān)系曲線能較好地用 Logistic曲線方程y=k/（1+ae-bx）進(jìn)行擬合，r2值在0.840～0.982之間，表明不同低溫處理的相對(duì)電導(dǎo)率的變化符合 Logistic方程的變化規(guī)律，與半致死溫度呈較強(qiáng)的線性關(guān)系，擬合結(jié)果較為精確，4個(gè)檸檬香茅資源的LT50從小到大依次是漳州香茅、永春香茅、新西蘭香茅、廣東香茅，半致死溫度依次為-21.81、-21.49、-21.13、-20.94 ℃。半致死溫度高，說明品種的抗寒性相對(duì)較差，易受低溫脅迫的危害?？梢?，漳州本地香蒿的抗寒性最好。

2.2 低溫脅迫下不同香茅品種SOD活性的變化

從表2可以看出，隨著溫度的降低，廣東香茅和永春香茅的SOD活性較為穩(wěn)定，廣東香茅在 -25 ℃ 時(shí)的酶活性為145.27 U/g，比15 ℃的酶活性134.35 U/g增加8.13%，永春香茅在 -25 ℃ 時(shí)的酶活性比15 ℃的酶活性增加21.20%;15～0 ℃，漳州香茅的SOD活性增加不顯著，當(dāng)溫度降至-25 ℃時(shí)，SOD的活性與前4個(gè)溫度相比，極顯著增加;另外，新西蘭香茅隨著溫度的降低，SOD活性整體逐漸增加，當(dāng)溫度降至 -25 ℃ 時(shí)，SOD的活性與前4個(gè)溫度相比極顯著增加。SOD的活性升高，表明植物在受到低溫脅迫時(shí)，是植物的酶保護(hù)系統(tǒng)對(duì)低溫的一種應(yīng)激反應(yīng)，起到保護(hù)植株的作用，可見漳州香茅、新西蘭香茅的抗寒性比廣東香茅、永春香茅好，各香茅品種資源的抗寒性表現(xiàn)為漳州香茅>新西蘭香茅>永春香茅>廣東香茅（表2）。

2.3 低溫脅迫下不同香茅品種POD活性的變化

從表3可以看出，4個(gè)香茅品種隨著脅迫溫度的降低，POD活性呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，其中廣東香茅的POD活性在15 ℃時(shí)為440.00 U/（g·min），溫度在 5 ℃ 時(shí)，其POD活性略有降低，但與15 ℃時(shí)的POD活性差異不顯著，隨著脅迫溫度的降低，POD活性不斷升高，在-25 ℃時(shí)POD活性為 1 086.67 U/（g·min），增加了146.97%;漳州香茅的POD活性與廣東香茅相似，5 ℃時(shí)略有下降，隨著脅迫溫度的降低，POD活性不斷升高，在-25 ℃時(shí)POD活性為 2 376.67 U/（g·min），增加了184.06%;新西蘭香茅的POD活性隨著溫度的降低不斷增加，在 -25 ℃ 時(shí)POD活性為1 476.67 U/（g·min），增加了486.75%;永春香茅的POD活性隨著溫度的降低不斷增加，在-25 ℃時(shí)POD活性為 856.67 U/（g·min），增加了252.06%;從POD活性累積來看，新西蘭香茅、永春香茅的POD活性明顯比其余2個(gè)品種的活性要高，POD活性的增加，表明抗寒能力增強(qiáng)，可見，新西蘭香茅、永春香茅的抗寒性高于其他2個(gè)品種。

2.4 低溫脅迫下不同香茅品種MDA含量的變化

由表4可知，4個(gè)香茅品種的丙二醛含量由15 ℃ 至-25 ℃均表現(xiàn)出上升的態(tài)勢(shì)。說明溫度越低，植物自身的受害程度越嚴(yán)重。但品種間對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，在脅迫的5個(gè)溫度下，廣東香茅的MDA含量明顯高于其他3個(gè)香茅品種，說明廣東香茅的抗寒能力低于其他3個(gè)香茅品種;漳州香茅在脅迫的5個(gè)溫度下，各脅迫溫度的MDA含量明顯低于其他3個(gè)品種，說明漳州香茅的受傷害程度小，而廣東香茅的受傷害程度大。

2.5 不同檸檬香茅資源的抗寒性綜合評(píng)價(jià)

應(yīng)用隸屬函數(shù)法對(duì)4個(gè)檸檬香茅資源各抗寒性生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析（表5）表明，漳州香茅的抗寒性優(yōu)于其他3個(gè)香茅資源，漳州香茅、永春香茅、新西蘭香茅、廣東香茅的平均隸屬度分別為 0.694 9、0.680 5、0.403 2、0.272 0。平均隸屬度綜合反映了品種資源的抗寒能力，其值越大則表明抗寒性越強(qiáng)。因此，低溫脅迫下4個(gè)香茅資源的抗寒性由強(qiáng)到弱依次為漳州香茅>永春香茅>新西蘭香茅>廣東香茅。

3 討論與結(jié)論

低溫使植物組織的細(xì)胞膜受損而發(fā)生電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率也隨之增大，因此電導(dǎo)率法逐漸廣泛應(yīng)用于植物耐寒性研究[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度的降低，各香茅品種的相對(duì)電導(dǎo)率逐漸增大，說明低溫處理對(duì)葉片細(xì)胞膜造成了傷害，當(dāng)溫度脅迫到-25 ℃時(shí)，4個(gè)香茅資源的相對(duì)電導(dǎo)率相當(dāng)，這表明4個(gè)香茅資源在-25 ℃細(xì)胞膜損傷程度相當(dāng)。低溫半致死溫度能較直觀準(zhǔn)確地反映植株的抗寒能力和耐低溫的能力，值越低表明抗寒性越強(qiáng)[17]，本試驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)檸檬香茅資源的LT50從小到大為漳州香茅、永春香茅、新西蘭香茅、廣東香茅，溫度依次為-21.81、-21.49、-21.13、 -20.94 ℃。該結(jié)果可為福建省乃至我國(guó)引種香茅資源的選擇和抗寒保護(hù)提供理論依據(jù)。

植物受到低溫脅迫時(shí)體內(nèi)活性氧產(chǎn)量增加，細(xì)胞膜脂過氧化作用增強(qiáng)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞受損或植株死亡。 SOD和POD是植物保護(hù)酶系統(tǒng)的關(guān)鍵酶類，在植物抵御低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，其活性大小與植物抗寒性強(qiáng)弱有一定的相關(guān)性，SOD活性大的種質(zhì)其抗寒性強(qiáng)。過氧化物酶則通過催化與其他底物發(fā)生反應(yīng)將 H2O2維持在一個(gè)較低的水平，防止過量積累，研究表明，抗寒性強(qiáng)的種質(zhì)過氧化物酶活性高于抗寒性弱的種質(zhì)[18-19]。本試驗(yàn)顯示，隨著脅迫溫度的降低，SOD與POD活性升高，其中廣東香茅和永春香茅的SOD活性比漳州香茅和新西蘭香茅要高，但是漳州香茅和新西蘭香茅在低溫-25 ℃時(shí)，活性成倍增加，達(dá)極顯著水平;從POD活性累積來看，新西蘭香茅、漳州香茅的POD活性明顯比其余2個(gè)品種的活性要高，POD活性的增加，表明抗寒能力增強(qiáng)，可見新西蘭香茅、漳州香茅的抗寒性高于其他2個(gè)品種。

丙二醛作為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，已經(jīng)成為衡量植物抗寒性的一個(gè)通用指標(biāo)，丙二醛含量越高，說明植物自身的受害程度越嚴(yán)重，并且在同一溫度下，丙二醛含量越高，說明植物抗逆性越差，即丙二醛含量與抗寒性呈負(fù)相關(guān)[20]。4個(gè)香茅資源的丙二醛含量由15 ℃至-25 ℃均表現(xiàn)出上升的態(tài)勢(shì)，且各脅迫溫度廣東香茅的丙二醛含量明顯高于其他3個(gè)香茅品種，說明廣東香茅的抗寒能力低于其他3個(gè)香茅品種;漳州香茅在脅迫的5個(gè)溫度下，丙二醛含量明顯低于其他3個(gè)品種，說明漳州香茅的受傷害程度小，而廣東香茅的受傷害程度大。

植物是一個(gè)統(tǒng)一的有機(jī)體，抗寒性是由多因素聯(lián)合控制的綜合性數(shù)量性狀，各項(xiàng)指標(biāo)能在一定程度上反映植株抗寒能力，如僅靠一種測(cè)定指標(biāo)難以對(duì)其抗寒性進(jìn)行客觀分析。利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)是常用的科學(xué)方法[21-22]。本研究依據(jù)隸屬函數(shù)值大小評(píng)價(jià)的抗寒性強(qiáng)弱順序?yàn)檎闹菹忝?永春香茅>新西蘭香茅>廣東香茅。

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