李曉玲 汪硯雨 徐梅 趙子明

1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南，洛陽(yáng) 471003 2.三門(mén)峽市中心醫(yī)院 3.鄭州市第七人民醫(yī)院

心律失常是最常見(jiàn)的誘發(fā)心源性猝死的病因之一，其發(fā)病率在近數(shù)十年來(lái)呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，且發(fā)病年齡日趨年輕化[1-2]。迄今為止，心律失常的治療仍以酒石酸美托洛爾等西藥治療為基礎(chǔ)，盡管引入了射頻消融術(shù)，但對(duì)于心律失常患者心肌損傷的改善效果仍不盡如人意。據(jù)研究報(bào)道，心肌細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激相關(guān)，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor2，Nrf2）被證實(shí)為細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下Nrf2被胞質(zhì)蛋白伴侶分子kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）錨定于細(xì)胞質(zhì)，一旦發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，Keap1-Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE） 抗氧化系統(tǒng)被激活，Keap1與Nrf2分離，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合ARE，啟動(dòng)以血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）為代表的抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用[3]。苓桂術(shù)甘湯是《傷寒雜病論》中經(jīng)典方劑，治療慢性心律失常療效確切[4]，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究以慢性心律失常大鼠模型為對(duì)象，觀察苓桂術(shù)甘湯對(duì)大鼠心肌損傷以及氧化應(yīng)激防御能力的影響，分析其保護(hù)慢性心律失常大鼠心肌組織的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF） 級(jí)SD大鼠45只，7周齡， 體質(zhì)量260～280g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0005]。實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼：SYXK（豫）2020-0004]，根據(jù)動(dòng)物福利委員會(huì)要求飼養(yǎng)，即在（23±1）℃恒溫、SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，自然通風(fēng)，人工照明，明暗各12h，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 苓桂術(shù)甘湯由茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草組成，比例為4:3:3:2，所有藥材購(gòu)于河北省承德市中藥材公司，品系鑒定符合中藥藥用標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)方法煎熬3次，混合3次濾液后，60℃水浴濃縮，制為內(nèi)含生藥2g·mL-1的藥液，于4℃冰箱內(nèi)保存。苓桂術(shù)甘湯的具體給藥劑量根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算，動(dòng)物與人每kg體重劑量折算系數(shù)是6.25，成人日總劑量為25g·kg-1，折算大鼠日用藥劑量為4g·kg-1。酒石酸美托洛爾（規(guī)格：25mg×20片）購(gòu)于阿斯利康制藥有限公司（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H32025391）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購(gòu)于中國(guó)碧云天生物公司（批號(hào)：20191106）；血清谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽硫基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所（批號(hào) ：20190913、20190922）；DNA 缺 口 末 端 標(biāo) 記 法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）染色試劑盒購(gòu)于北京博奧森生物科技有限公司（批號(hào)：20191213）；兔抗大鼠β-actin、Nrf2、HO-1單克隆抗體（一抗）以及辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司（批號(hào)：20190815、20190712、20190206、20190528）。DB-3型心電圖機(jī)為上海廣電醫(yī)用電子儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、LW300-28LT型生物顯微鏡均購(gòu)于西安禾普生物科技有限公司；UVCI-01型機(jī)載凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；EG1150H型包埋機(jī)為德國(guó)徠卡微系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組與干預(yù) 從45只大鼠中隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，其余35只大鼠尾靜脈注射氯化鋇溶液，以制備慢性心律失常大鼠模型[5]。造模方法：稱量大鼠體質(zhì)量，按照體質(zhì)量腹腔注射2%戊巴比妥鈉1mL/400g，充分麻醉后將大鼠俯臥位固定在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，在四肢內(nèi)側(cè)皮下置入針狀電極，連接DB-3型心電圖機(jī)，基線調(diào)零，描記Ⅱ?qū)?lián)心電圖。待大鼠心電圖正常平穩(wěn)后，對(duì)其尾部充分消毒，于尾靜脈5s內(nèi)注射0.4%氯化鋇溶液4mg·kg-1，快速記錄心電圖，共記錄0.5h。正常對(duì)照組大鼠的麻醉、固定操作同上，尾靜脈注射等體積0.9%氯化鈉溶液。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠心電圖出現(xiàn)典型慢性心律失常表現(xiàn)，表示造模成功[5]。

共30只大鼠造模成功，將造模成功大鼠隨機(jī)分為苓桂術(shù)甘湯組、陽(yáng)性對(duì)照組和模型對(duì)照組，每組各10只。造模成功后當(dāng)天，苓桂術(shù)甘湯組予苓桂術(shù)甘湯生藥4g/（kg·d）灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組予酒石酸美托洛爾20mg/（kg·d）灌胃，模型對(duì)照組、正常對(duì)照組予以等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。灌胃體積均為10mL·kg-1，早晚各1次，每次持續(xù)1min，共4周。

1.2.2 取材 灌胃第4周末，各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉1mL/400g麻醉，開(kāi)胸后完整分離心臟，以預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸干。一部分心肌組織以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后觀察心肌組織的病理改變；一部分液氮冷凍，備行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）和Western blot檢測(cè)。

1.2.3 血清GSH、GST含量檢測(cè) 取材過(guò)程同1.2.2，經(jīng)心臟取血2mL，靜置后3 000r/min離心10min，離心半徑10cm，分離血清，采用ELISA檢測(cè)血清GSH、GST含量。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)吸光度，并以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到直線回歸方程，將樣品吸光度帶入方程，計(jì)算出樣品含量。

1.2.4 心肌組織病理變化的HE染色觀察 取1.2.2制作的心肌組織切片，脫蠟、水化后，蘇木素染色5min，自來(lái)水沖洗1min，梯度乙醇分化15s，自來(lái)水沖洗0.5h，0.5%伊紅染色1min，蒸餾水沖洗30s，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，400倍光鏡下觀察心肌組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 按TUNEL染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，各組石蠟切片常規(guī)入水脫蠟，蒸餾水洗滌切片，37℃加入以Tris緩沖鹽溶液1:100新鮮稀釋的蛋白酶K，孵育10min后，蒸餾水洗滌，37℃加入末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）、異羥基洋地 黃毒苷（digoxigenin，Dig）配基-脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP）標(biāo)記的緩沖液20μL，孵育2h后以Tris緩沖鹽溶液洗滌，室溫加入封閉液50μL，0.5h后甩干，37℃加入封閉液1:100稀釋的生物素標(biāo)記抗Dig抗體50μL，孵育0.5h后以Tris緩沖鹽溶液洗滌，37℃加入Tris緩沖鹽溶液1:100稀釋的鏈酶親合素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，孵育0.5h后以Tris緩沖鹽溶液洗滌，二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB） 顯色20min，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染，Tris緩沖鹽溶液洗滌，脫水，透明、封片，400倍光鏡下觀察大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核呈黃染，每張切片隨機(jī)抽選10個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率，心肌細(xì)胞凋亡率（%）=（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.6 心肌組織中Nrf2、HO-1基因表達(dá)檢測(cè) 取心肌組織，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，電泳觀察RNA完整性。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物由上海生工生物工程公司合成，序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增 體 系 共25μL， 包 括SYBR Green Mix 12.5μL、ddH2O 9.5μL、 上下游引物各0.5μL、cDNA模板2μL。反 應(yīng) 條 件 ：95℃ 10min，95℃ 10s，60℃ 1min，95℃15s，60℃ 15s，共40個(gè)循環(huán)。采集目的基因及內(nèi)參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）各個(gè)循環(huán)擴(kuò)增的熒光信號(hào)引物，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線與熔解曲線，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采取2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 心肌組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 提取心肌組織總蛋白，加入500μL細(xì)胞裂解液，BCA法測(cè)定蛋白總量，蛋白與上樣緩沖液混勻后，沸水浴變性，冷卻后行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5h，加入兔抗大鼠Nrf2、HO-1、β-actin一抗（稀釋比例1∶1 000），4℃搖床過(guò)夜，洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1∶8 000），室溫孵育1h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢驗(yàn)，PVDF膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育后，膠片曝光顯影。采用凝膠成像儀機(jī)載Labworks軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用Fisher最小顯著性差異（least significant difference，LSD）-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模大鼠心電圖觀察 35只造模大鼠中30只造模成功，苓桂術(shù)甘湯組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型對(duì)照組各10只，均出現(xiàn)心律失常的典型心電圖表現(xiàn)，即ST段T波改變、異常Q波，造模成功率85.71%。見(jiàn)圖1。

圖1 造模大鼠心電圖表現(xiàn)Fig.1 Electrocardiogram of model rats

2.2 各組大鼠GSH和GST含量比較 各組間總體比較，GSH和GST含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組大鼠的GSH和GST含量較低（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組大鼠的GSH和GST含量較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，苓桂術(shù)甘湯組大鼠的GSH和GST含量較低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠的GSH、GST含量比較（±s）Tab.2 Comparison of GSH and GST contents of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠的GSH、GST含量比較（±s）Tab.2 Comparison of GSH and GST contents of rats in each group（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.05Note:Compared with normal control group， *P＜0.05;compared with model control group， △P＜0.05;compared with positive control group，#P＜0.05

組別 n GSH（mg·gprot-1） GST（U·mgprot-1）正常對(duì)照組 10 1.09±0.21 94.39±5.58模型對(duì)照組 10 0.56±0.13* 82.17±3.28*陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.91±0.15*△ 92.67±4.46*△苓桂術(shù)甘湯組 10 0.76±0.16*△# 88.11±4.69*△#F值 18.552 14.245 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 各組大鼠心肌組織病理變化 HE染色提示，正常對(duì)照組大鼠心肌組織肌束清晰、排列規(guī)則，無(wú)水腫、充血；模型對(duì)照組大鼠心肌組織水腫、充血嚴(yán)重，肌束紊亂明顯，心肌細(xì)胞間隙增寬；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組心肌組織輕度水腫、充血，肌束有輕微模糊、紊亂情況，心肌細(xì)胞間隙縮小。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理變化（HE染色，400×）Fig.2 Pathological changes of myocardial tissue in each group（HE staining， 400×）

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 顯微鏡下正常心肌細(xì)胞核為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核為棕褐色，正常對(duì)照組心肌極少見(jiàn)凋亡細(xì)胞，模型對(duì)照組凋亡細(xì)胞增多且分布密集；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組凋亡細(xì)胞減少。見(jiàn)圖3。各組間總體比較，心肌細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率較高 （P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率較低（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，苓桂術(shù)甘湯組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率較高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of apoptosis rate of Cardiomyocytes in each group（±s，%）

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of apoptosis rate of Cardiomyocytes in each group（±s，%）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.05Note:Compared with normal control group， *P＜0.05;compared with model control group， △P＜0.05;compared with positive control group，#P＜0.05

細(xì)胞凋亡率正常對(duì)照組 10 6.31±0.29模型對(duì)照組 10 15.36±0.72*陽(yáng)性對(duì)照組 10 12.64±0.59*△苓桂術(shù)甘湯組 10 13.71±0.62*△#F值 469.406 P值 ＜0.001組別n

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色，400×）Fig.3 Cardiomyocytes apoptosis in each group（TUNEL staining， 400×）

2.5 各組大鼠Nrf2、HO-1基因表達(dá)比較 各組間總體比較，心肌細(xì)胞Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組大鼠的Nrf2、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組大鼠Nrf2、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，苓桂術(shù)甘湯組大鼠Nrf2、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較低（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of expressions of Nrf2 and HO-1 mRNA in each group（±s）

表4 各組大鼠Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of expressions of Nrf2 and HO-1 mRNA in each group（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.05Note:Compared with normal control group， *P＜0.05;compared with model control group， △P＜0.05;compared with positive control group，#P＜0.05

組別 n Nrf2 HO-1正常對(duì)照組 10 0.25±0.05 0.56±0.11模型對(duì)照組 10 0.42±0.07* 0.69±0.13*陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.78±0.13*△ 0.95±0.17*△苓桂術(shù)甘湯組 10 0.66±0.11*△# 0.81±0.15*△#F值 62.225 13.810 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.6 各組大鼠Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較 各組間總體比較，心肌細(xì)胞Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組大鼠的Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均較高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組大鼠Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均較高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，苓桂術(shù)甘湯組大鼠Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均較低（P＜0.05）。 見(jiàn)表5、圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)Fig.4 Nrf2 and HO-1 protein expressions in each group detected with Western blot

表5 各組大鼠Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of expressions of Nrf2 and HO-1 protein in each group（±s）

表5 各組大鼠Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of expressions of Nrf2 and HO-1 protein in each group（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.05Note:Compared with normal control group， *P＜0.05;compared with model control group， △P＜0.05;compared with positive control group，#P＜0.05

組別 n Nrf2 HO-1正常對(duì)照組 10 0.17±0.02 0.51±0.05模型對(duì)照組 10 0.25±0.04* 0.62±0.09*陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.59±0.08*△ 0.89±0.09*△苓桂術(shù)甘湯組 10 0.41±0.06*△# 0.75±0.08*△#F值 115.000 42.961 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

心律失常為諸多心臟疾病的癥狀表現(xiàn)，是導(dǎo)致患者死亡的主要病因，因而應(yīng)對(duì)慢性心律失常予以高度重視[6]。慢性心律失常的發(fā)病機(jī)制可能為竇房結(jié)激動(dòng)異常、傳導(dǎo)速度減慢，或傳導(dǎo)阻滯而導(dǎo)致心臟搏動(dòng)頻率紊亂，以胸悶、失眠、心悸為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致暈厥或猝死[7-8]?，F(xiàn)階段臨床上治療慢性心律失常以阿托品等常規(guī)藥物為主，但不良反應(yīng)明顯等問(wèn)題，且高齡患者的藥物代謝能力和對(duì)藥物的反應(yīng)能力均下降，故探索其他更安全、高效的治療方法十分必要。從中醫(yī)學(xué)角度而言，慢性心律失常是因患者臟腑內(nèi)氣血陰陽(yáng)虛損，氣滯血瘀，引起心脈失暢、心失所養(yǎng)而致病。經(jīng)中醫(yī)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，苓桂術(shù)甘湯作為治療心胸滿悶、氣上沖胸、氣短等癥的溫陽(yáng)益氣之祖方，用于心血管疾病的治療效果良好[9]，但對(duì)慢性心律失常的作用及其具體作用機(jī)制的研究少見(jiàn)，亟待深入分析。

研究表明，慢性心律失常導(dǎo)致心肌損傷的過(guò)程實(shí)質(zhì)上是氧自由基產(chǎn)生、心肌細(xì)胞凋亡的病理生理過(guò)程，GSH作為低分子清除劑，可在細(xì)胞代謝過(guò)程中發(fā)揮清除氧自由基、抗氧化應(yīng)激等功能，是細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵組成部分[10]。GST在機(jī)體各組織器官中廣泛存在，可催化外源有害物質(zhì)和還原型谷胱甘肽巰基發(fā)生偶聯(lián)，將有害物質(zhì)代謝分解后排出體外，發(fā)揮解毒和清除過(guò)氧化物的雙重功能。本研究結(jié)果顯示，慢性心律失常大鼠體內(nèi)衡量抗氧化防御能力的GSH、GST含量明顯降低，提示慢性心律失常大鼠抗氧化防御體系受損，抗氧化應(yīng)激損傷能力下降，通過(guò)酒石酸美托洛爾、苓桂術(shù)甘湯治療可有效恢復(fù)大鼠抗氧化能力，從而減輕心肌組織損傷。據(jù)報(bào)道，個(gè)體長(zhǎng)期處于心律失常狀態(tài)下，氧自由基的產(chǎn)生與清除平衡失調(diào)，容易造成氧自由基蓄積，可直接損傷心肌細(xì)胞，致使其壞死、凋亡，加重心律失常病情[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，而陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組則有所下降，苓桂術(shù)甘湯組心肌細(xì)胞凋亡率雖稍高于陽(yáng)性對(duì)照組，但仍然低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示苓桂術(shù)甘湯在挽救慢性心律失常大鼠心肌細(xì)胞凋亡方面有一定價(jià)值。苓桂術(shù)甘湯方中茯苓補(bǔ)益心脾、寧心安神，桂枝振心陽(yáng)、止悸動(dòng)、通血脈，白術(shù)補(bǔ)氣養(yǎng)神，甘草補(bǔ)中益氣、通陽(yáng)化氣?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桂枝有效成分可減少兒茶酚胺分泌，保護(hù)心臟[12]；甘草可降低心臟異位起搏點(diǎn)興奮性，調(diào)節(jié)心臟傳導(dǎo)功能[13]；茯苓、白術(shù)亦有調(diào)節(jié)心律作用，共奏平復(fù)心律、安神定悸之效[14-15]。同時(shí)，HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組心肌充血嚴(yán)重、肌束紊亂，而與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組心肌組織血紅蛋白逸出、細(xì)胞核堆積等異常情況比較輕微，進(jìn)一步提示苓桂術(shù)甘湯對(duì)慢性心律失常大鼠心肌損傷有一定保護(hù)作用。

Nrf2為Keap1-Nrf2/ARE抗氧化系統(tǒng)中的重要蛋白，Keap1-Nrf2/ARE抗氧化系統(tǒng)是細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制中的關(guān)鍵通路，Nrf2通路負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)HO-1等抗氧化酶基因表達(dá)，發(fā)揮其保護(hù)效應(yīng)。Keap1是Nrf2特異性受體，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Keap1和Nrf2解離，Nrf2與ARE結(jié)合，啟動(dòng)ARE調(diào)控的第Ⅱ相抗氧化酶基因表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的拮抗能力。ARE所調(diào)控的抗氧化酶基因主要包括HO-1和GST等。HO-1屬于氧化應(yīng)激蛋白，是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，可催化血紅素生成膽綠素、鐵離子、一氧化碳，在氧化性心肌損傷中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)，同時(shí)與其酶解產(chǎn)物膽紅素共同發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡等作用，還可降低組織對(duì)氧化應(yīng)激損傷的敏感程度。Nrf2為其主要上游調(diào)控基因，正常生理狀態(tài)下的HO-1表達(dá)較低，在氧化應(yīng)激條件下可通過(guò)Nrf2通路啟動(dòng)HO-1表達(dá)，表現(xiàn)出抗氧化作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)，提示慢性心律失?？烧T發(fā)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，激活Nrf2基因并增強(qiáng)Nrf2蛋白表達(dá)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)下游HO-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、苓桂術(shù)甘湯組Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量較高。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)苓桂術(shù)甘湯治療慢性心律失常的主要機(jī)制可能是促進(jìn)細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路活化，誘導(dǎo)抗氧化酶類如HO-1表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，從而抵抗氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)機(jī)體免受毒性物質(zhì)侵害，抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究以臨床常用藥物酒石酸美托洛爾作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果提示苓桂術(shù)甘湯治療慢性心律失常的效果弱于酒石酸美托洛爾，但結(jié)合臨床實(shí)踐，與西藥比較，中藥不良反應(yīng)更少，安全性較高，因此筆者認(rèn)為苓桂術(shù)甘湯可以作為慢性心律失常的一種治療選擇。

綜上所述，苓桂術(shù)甘湯可抑制慢性心律失常大鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1通路有關(guān)。中藥復(fù)方的藥效與方中藥物的藥理活性有關(guān)，苓桂術(shù)甘湯阻止慢性心律失常大鼠心肌細(xì)胞凋亡的藥理學(xué)效應(yīng)可能涉及多方面機(jī)制，是藥物多靶點(diǎn)、微效應(yīng)的綜合表現(xiàn)，Nrf2/HO-1信號(hào)通路或許是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。但本研究仍存在諸多不足，如觀察指標(biāo)較少等，未來(lái)應(yīng)從多角度進(jìn)行研究，并分析其他可能存在的作用機(jī)制，為苓桂術(shù)甘湯治療慢性心律失常的可行性提供更多依據(jù)。