袁溢苒 陳龍 張臻

肝癌，包括成人的肝細(xì)胞癌(HCC)和膽管癌(CCA)，以及主要在兒童中發(fā)病的肝母細(xì)胞瘤(HB)，是目前對(duì)抗癌藥物反應(yīng)不良的最惡性腫瘤之一[1-2]。有許多證據(jù)表明，多種miRNA在肝癌組織中顯示失調(diào)，并在癌癥的發(fā)展中起重要作用，包括miR-548a-5p[3-4]。miR-548a-5p是前列腺疾病的病程變化的腫瘤標(biāo)志物[5]。然而，關(guān)于miR-548a-5p在肝癌中的生物學(xué)作用，目前尚未有研究。miR-548a-5p是否與凋亡相關(guān)，其潛在的分子機(jī)制值得探討?；诖耍狙芯恳愿伟┘?xì)胞HepG2作為研究對(duì)象，旨在探討miR-548a-5p調(diào)控肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的潛在機(jī)制。

材料與方法

一、一般材料

肝癌細(xì)胞HepG2購自procell公司(貨號(hào)：CL-0103)。LIPOFECTAMINE MESSENGERMAX轉(zhuǎn)染試劑購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司(貨號(hào)：LMRNA008)。GAPDH的抗體購自上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司[貨號(hào)：ml4041550(s)]。HMBOX1(homeobox containing 1)抗體購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：10R-1687)。siGFP和siHMBOX1(靶序列：GGAAGTTCATATGGGAATA)由吉?jiǎng)P基因合成。HMBOX1過表達(dá)質(zhì)粒通過肝癌細(xì)胞HepG2的cDNA克隆至pCDNA3.1表達(dá)載體上。RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京普益華科技有限公司(貨號(hào)：R8005-10X1L)。胎牛血清購自廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司(貨號(hào)：HQ30071)?？俁NA小量提取試劑盒購自廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司(貨號(hào)：T2010S)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自廣州聚研生物科技有限公司(貨號(hào)：116.C6028-50T)。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：R1041)。

二、研究方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人肝癌細(xì)胞系HepG2(HCC/HB)在補(bǔ)充有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)制造商的說明，LIPOFECTAMINE MESSENGERMAX轉(zhuǎn)染試劑與siGFP、siHMBOX1、miR-548a-5p mimics、miR-548a-5p inhibitor、Vector和HMBOX1混合后轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。

(二)免疫印跡 從用RIPA裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉，150 mmol/L NaCl和1 mmol/L PMSF裂解的細(xì)胞中提取總蛋白，并用BSA測(cè)定濃度方法。通過在10%聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE分離蛋白(30 μg/泳道)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。在室溫下，將膜用5%脫脂牛奶在TBS/0.1% Tween-20中封閉1 h。然后用特異性抗體(1∶1 000)檢測(cè)HMBOX1和GAPDH。將蛋白質(zhì)與二抗在室溫下孵育1 h，并使用Immobilon Western化學(xué)發(fā)光HRP底物觀察條帶，并使用Alpha Ease FC軟件進(jìn)行分析。

(三)Annexin-V染色 經(jīng)過不同處理后，收集在6孔板上生長的漂浮，肝癌細(xì)胞HepG2和胰蛋白酶分離的細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS洗滌。然后將細(xì)胞沉淀物用結(jié)合緩沖液重懸，并根據(jù)試劑盒方案用Annexin-V染色。熒光顯微鏡觀察。將實(shí)驗(yàn)組中凋亡細(xì)胞的百分比與對(duì)照轉(zhuǎn)染組進(jìn)行比較。所有樣品一式三份測(cè)量。

(四)RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 使用總RNA小量提取試劑盒從細(xì)胞中提取總RNA，并根據(jù)制造商的說明使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。協(xié)議。使用iCycleriQ實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)特定的轉(zhuǎn)錄本。將特定轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化至GAPDH水平。qRT-PCR從變性(95 ℃持續(xù)25 s)，退火(60 ℃持續(xù)20 s)和延伸(72 ℃持續(xù)30 s)三個(gè)步驟開始。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、miR-548a-5p抑制肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡

轉(zhuǎn)染miR-548a-5p mimics過表達(dá)miR-548a-5p后，檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果顯示HepG2的凋亡水平下降；轉(zhuǎn)染miR-548a-5p inhibitor敲低miR-548a-5p后，檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果顯示HepG2的凋亡水平上升(P<0.05)。這說明miR-548a-5p能抑制肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡

二、miR-548a-5p靶向HMBOX1

通過miRDB在線分析發(fā)現(xiàn)，miR-548a-5p潛在靶向FAM135A,NFAT5,RORA,FIGN,HMBOX1,CCNY,RMND5A,LRRTM3,UBE2A,RALA基因。過表達(dá)miR-548a-5p后，HMBOX1的水平顯著下降(P<0.05)；敲低miR-548a-5p后，HMBOX1的水平顯著上升(P<0.05)，其余基因均無顯著變化。通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-548a-5p靶向HMBOX1的3端非編碼區(qū)(P<0.05)。

三、miR-548a-5p靶向HMBOX1抑制肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡

通過siRNA敲低HMBOX1后，發(fā)現(xiàn)HepG2的凋亡水平顯著下降(P<0.05)；通過HMBOX1質(zhì)粒過表達(dá)HMBOX1后，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡水平顯著上升(P<0.05)。同時(shí)過表達(dá)或敲低miR-548a-5p和HMBOX1，HepG2的凋亡水平無明顯變化。敲低和過表達(dá)效率見圖3A和圖3B。因此，miR-548a-5p靶向HMBOX1抑制HepG2的凋亡。

圖1 HMBOX1促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡(P<0.05)

討 論

miRNA在基本的細(xì)胞過程中起著至關(guān)重要的作用，這些過程包括但不限于增殖、發(fā)育、分化、凋亡和自噬[6-7]。在本研究中，miRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可忽視的調(diào)控作用，主要是通過靶向于相關(guān)通路中的關(guān)鍵基因?qū)崿F(xiàn)的，包括凋亡、自噬等信號(hào)通路[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)miR-548a-5p是前列腺癌病程變化的標(biāo)志基因，也與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-548a-5p后，HepG2的凋亡水平下降；敲低miR-548a-5p后，凋亡水平上升(P<0.05)，因此，miR-548a-5p可能是治療肝癌的潛在治療靶點(diǎn)。miRDB在線分析發(fā)現(xiàn)miR-548a-5p潛在靶向FAM135A,NFAT5,RORA,FIGN,HMBOX1,CCNY,RMND5A,LRRTM3,UBE2A,RALA基因。過表達(dá)miR-548a-5p后，HMBOX1的表達(dá)明顯下降；敲低miR-548a-5p后，其表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。miRNA通過與3’UTR結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而引起mRNA降解或翻譯抑制。因此，本研究通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)miR-548a-5p靶向于HMBOX1的3端非編碼區(qū)(P<0.05)。

HMBOX1是一種新的人類homeobox基因，首次從人類胰腺cDNA文庫中分離得到，是一種轉(zhuǎn)錄因子，研究表明，其可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖[12-13]。敲低HMBOX1后，HepG2的凋亡水平顯著下降；而過表達(dá)后則相反(P<0.05)。Lin等[14]報(bào)道HMBOX1通過與MT2A相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離鋅水平，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞自噬。同時(shí)敲低或過表達(dá)miR-548a-5p和HMBOX1，凋亡水平未發(fā)生明顯改變。因此，作為HMBOX1的上游，miR-548a-5p可能抑制細(xì)胞自噬。細(xì)胞自噬已經(jīng)被證明與癌癥耐藥相關(guān)[15]。因此，miR-548a-5p可能是肝癌耐藥的潛在原因之一。

綜上所述，miR-548a-5p通過靶向HMBOX1的mRNA的3端非編碼區(qū)抑制HMBOX1的翻譯，從而抑制肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡。