◎ 周 楊，胡嘉琪，趙純曦，朱 祺，殷 玲

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300）

蜜蜂巢脾含有大量的生物活性成分，其中多糖是巢脾中的主要活性成分[1-2]。蜜蜂巢脾多糖來源復雜，源于巢脾是蜜蜂世代棲息和繁衍的場所，也是蜜蜂貯存蜂蜜、花粉、蜂王漿、蜂膠的場所，老巢脾中殘留大量蜂產(chǎn)品、幼蟲繭衣及其分泌物，因此巢脾多糖很可能是動植物多糖的復合物[3]。研究前期發(fā)現(xiàn)巢脾多糖具有較好的抗氧化活性、抗脂質氧化活性、對于環(huán)磷酰胺對小鼠造成的免疫抑制也有一定的免疫調節(jié)活性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，巢脾多糖有較好的抗氧化活性[4]，而多糖的生物學活性受到多糖分子量的影響。為進一步分析不同分子量巢脾多糖的生物活性，本試驗采用超濾法對巢脾多糖進行分級分離，獲得分子量為 4 ～ 100 kDa（HCP-L） 和 ＞ 100 kDa（HCP-H）2個不同分子量段的巢脾多糖，并對2個分子量段巢脾多糖的抗氧化活性及抑菌活性進行比較分析，以期篩選出活性更好的巢脾多糖組分，從而為進一步研究蜜蜂巢脾多糖的生物活性及開發(fā)應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西方蜜蜂老巢脾（使用3年以上）。

抗超氧陰離子測定試劑盒、羥自由基測定試劑盒、總抗氧化測定試劑盒，均購自南京建成生物制藥研究所。

無水乙醇（無錫佳妮化工有限公司）、硫化鋇（國藥集團化學試劑有限公司）、氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）、硫酸（國藥集團化學試劑有限公司）等均為分析純。

枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌均為購自中國藥品生物制品菌檢定所的凍干粉。

1.2 儀器與設備

MSC300超濾杯及截留分子量為4 kDa、100 kDa的超濾膜，上海魔速科學器材有限公司；紫外可見分光光度計T6，北京普析通用儀器有限公司；雙光束紫外可見分光光度TU-1901，北京普析通用儀器有限公司；雙人單面垂直凈化工作臺 SW-CJ-2FD，吳江市亞泰凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜜蜂巢脾多糖的提取及分級

粉碎的蜜蜂巢脾→按1∶15比例加入蒸餾水→50 ℃水浴鍋水浴90 min→120目紗布過濾→重復3次→濃縮至體積大幅度減少→冷卻離心→1∶4無水乙醇→4 ℃靜置過夜→沉淀離心得蜜蜂巢脾粗多糖→去色素→去蛋白得蜜蜂巢脾多糖→依次使用截留分子量的為4 kDa、100 kDa的超濾膜超濾→獲得分子量為4～100 kDa（HCP-L）、＞100 kDa（HCP-H）的多糖樣品。

1.3.2 體外抗氧化能力檢測

按照試劑盒方法測定各分子量段的巢脾多糖體外抑制羥自由基能力、抗超氧陰離子能力及總抗氧化能力。

1.3.3 巢脾多糖的抑菌性試驗

菌種復蘇并傳2代后，挑取細菌菌落置10 mL血清肉湯培養(yǎng)基于37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)24 h，取出離心（2 000 r·min-1，10 min），用無菌生理鹽水洗滌，采用麥氏比濁法用無菌生理鹽水參照[9]的方法稀釋成不同濃度懸菌液，以青霉素鉀溶作為陽性對照，生理鹽水作為陰性對照，采用紙片擴散法[5]測定兩組巢脾多糖的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 不同分子量段蜜蜂巢脾多糖溶液對供試菌的抑菌性

2.1.1 蜜蜂巢脾多糖對肺炎鏈球菌的抑菌性

以濾紙片周圍抑菌圈的直徑大小作為巢脾多糖抑菌效果的測定指標，用游標卡尺測量培養(yǎng)皿中濾紙片對1×108CFU·mL-1的肺炎鏈球菌的抑菌圈直徑（包含濾紙片的直徑6 mm，下同）。兩個分子量段蜜蜂巢脾多糖對肺炎鏈球菌的抑菌性情況如圖1所示。

圖1 兩個分子量段蜜蜂巢脾多糖對肺炎鏈球菌的抑菌性圖

由圖1可知，兩個分子量段的巢脾多糖對肺炎鏈球菌均有較好的抑菌活性，且其抑菌活性均呈現(xiàn)濃度依賴性，在多糖濃度為200 mg·mL-1時，兩個分子量段的巢脾多糖均對肺炎鏈球菌呈現(xiàn)最大抑菌活性，在此濃度下HCP-L及HCP-H產(chǎn)生的抑菌圈分別是15.72 mm及14.82 mm。在6個濃度梯度下，HCP-L對肺炎鏈球菌的抑菌活性均稍強于HCP-H，但是兩個分子量的巢脾多糖對肺炎鏈球菌的抑制作用差異并不明顯。

但是這些努力沒有來得及挽回另外3個受害者的生命：27歲的瑪麗·瑞娜剛剛生完小孩，正在休產(chǎn)假，結果服了有毒膠囊，當場喪生。美國航空公司空乘波拉·普林斯死在芝加哥郊區(qū)的家中，身邊是泰諾速效膠囊的藥瓶。同樣慘遭厄運的還有與她同齡的瑪麗·邁克菲蘭。短短兩天，小小的膠囊就奪走了7條人命。

2.1.2 蜜蜂巢脾多糖對枯草芽孢桿菌的抑菌性

由圖2可知，兩個分子量段的巢脾多糖對枯草芽孢桿菌均有較好的抑菌活性，其抑菌活性均呈現(xiàn)一定濃度依賴性，在多糖濃度為200 mg·mL-1時兩個分子量段的巢脾多糖均對枯草芽孢桿菌呈現(xiàn)最大抑菌活性，在此濃度下HCP-L及HCP-H產(chǎn)生的抑菌圈分別是11.79 mm及10.83 mm。在6個濃度梯度下，HCP-L對枯草芽孢桿菌的抑菌活性均稍強于HCP-H，但是總體而言兩個分子量的巢脾多糖對肺炎鏈球菌的抑制作用差異并不顯著。

圖2 兩個分子量段蜜蜂巢脾多糖對枯草芽孢桿菌的抑菌性圖

2.1.3 蜜蜂巢脾多糖對大腸桿菌的抑菌性

兩個分子量段巢脾多糖對大腸桿菌的抑菌活性檢測結果如圖3所示，HCP-H對大腸桿菌不具有抑菌活性，而HCP-L則對大腸桿菌均有較好的抑菌活性，其抑菌活性均呈現(xiàn)一定濃度依賴性，在多糖濃度為200 mg·mL-1時對肺炎鏈球菌呈現(xiàn)最大抑菌活性，在此濃度下產(chǎn)生的抑菌圈是11.24 mm。

圖3 兩個分子量段蜜蜂巢脾多糖對大腸桿菌的抑菌性圖

2.1.4 蜜蜂巢脾糖對金黃色葡萄球菌的抑菌性

兩個分子量段巢脾多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌活性檢測結果如圖4所示，兩個分子量段的巢脾多糖對金黃色葡萄球菌均有較好的抑菌活性，其抑菌活性均呈現(xiàn)一定濃度依賴性，在多糖濃度為200 mg·mL-1時兩個分子量段的巢脾多糖均對金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)最大抑菌活性，在此濃度下HCP-H及HCP-L產(chǎn)生的抑菌圈分別是11.28 mm及13.65 mm。在6個濃度梯度下，HCP-L對金黃色葡萄球菌的抑制作用均強于HCP-H。

圖4 兩個分子量段蜜蜂巢脾多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌性圖

研究表明，動植物多糖具有體外直接抑菌活性[6-8]，本研究結果顯示，兩個分子量段巢脾多糖對肺炎鏈球菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌均具有較好的體外抑菌活性?？咕衔锏目咕鷻C制包括細胞壁的破壞、膜通透性的變化、蛋白質和核酸分子的變化、酶的抑制及核酸合成的抑制等[9-10]。本研究中不同分子量的巢脾多糖對不同的細菌呈現(xiàn)出不同的抑菌活性，低分子量的HCP-L略高于高分子量的HCP-H，說明分子量對巢脾多糖抑菌活性的有一定影響，推測其原因可能是巢脾多糖對細菌的抑制主要是通過破壞細胞壁來作用，高、低分子量的巢脾多糖對細胞壁的破壞作用沒有差異或者差異不大，而低分子量的巢脾多糖由于分子量小，更易通過細胞膜進入細胞內(nèi)，進一步對蛋白質和核酸產(chǎn)生微量作用，因此抑菌作用略高于高分子量巢脾多糖。這一推測還需要進一步研究證實。此外，HCP-H對大腸桿菌不具有抑菌活性，而HCP-L則對大腸桿菌具有較好的抑菌活性，杜恒裔等[7]也發(fā)現(xiàn)滸苔多糖對大腸桿菌無抑制活性，其具體原因及機制還需要進一步分析研究。但是兩個分子量巢脾多糖的抑菌活性差異并不顯著，因此從生產(chǎn)實際出發(fā)對其進行分離純化沒有意義。

2.2 兩個分子量多糖的體外抗氧化活性比較分析

2.2.1 抑制羥自由基能力測定結果

兩個分子量段巢脾多糖抑制羥自由基能力測定結果如圖5所示，兩個分子量段巢脾多糖均具有較好的抑制羥自由基能力，且與濃度呈現(xiàn)量效關系。多糖濃度在5～20 mg·mL-1時，HCP-L和HCP-H抑制羥自由基的能力隨著濃度的升高逐漸增強，且HCP-L的抑制羥自由基能力強于HCP-H；當濃度為20～40 mg·mL-1時，HCP-H抑制羥自由基能力隨著濃度的增加迅速增加，超過HCP-L。

圖5 兩個分子量段巢脾多糖對羥自由基的清除能力圖

2.2.2 抗超氧陰離子自由基測定結果

兩個分子量段巢脾多糖抗超氧陰離子自由基測定結果如圖6所示，兩個分子量段巢脾多糖均具有較好的抑制羥自由基能力，且與濃度呈現(xiàn)量效關系。當多糖濃度＜20 mg·mL-1時，兩個分子量段的巢脾多糖的抗超氧陰離子能力差異不大；當濃度為20～40 mg·mL-1時，HCP-H的抗超氧陰離子能力呈持續(xù)上升趨勢且明顯強于HCP-L，HCP-L的抗超氧陰離子能力在多糖濃度為40 mg·mL-1達到最高 37.78 U·L-1。

圖6 兩個分子量巢脾多糖對超氧陰離子的清除能力圖

2.2.3 總抗氧化能力測定結果

不同分子量段多糖的總抗氧化能力測定結果如圖7所示，兩個分子量段巢脾多糖均具有較好的總抗氧化能力，且與濃度呈現(xiàn)量效關系，HCP-H的總抗氧化能力略大于HCP-L。

圖7 兩個分子量巢脾多糖對總抗氧化能力的測定圖

多糖是一類具有多種活性的生物大分子[11-14]，其中研究較多的是抗氧化活性[15-18]，但是對不同分子量多糖活性的研究較少[19-20]。本研究結果顯示，兩個分子量段的巢脾多糖都具有較好的抗氧化活性，且HCP-H較HCP-L具有較好的抗氧化活性。

3 結論

課題組前期研究結果表明，巢脾多糖具有較好的體外抗氧化活性，為進一步研究其生物活性，以更好地應用于生產(chǎn)實際，本實驗利用超濾技術將巢脾多糖分為分子量4～100 kDa（HCP-L）及大于100 kDa（HCP-H）兩個級別，首先采用紙片擴散法測定HCP-L和HCP-H對肺炎鏈球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌性，并對其體外抗氧化活性進行檢測。實驗結果表明HCP-L的抑菌活性略高于HCP-H，而HCP-H較HCP-L具有較好的抗氧化活性。

中國是傳統(tǒng)養(yǎng)蜂大國，每年淘汰的老巢脾數(shù)量可觀，而這些老巢脾大都被用來提取蜂蠟，其中水溶性的活性物質如多糖常常被丟棄，本研究結果提示，巢脾多糖可作為天然保鮮劑進行開發(fā)，同時若生產(chǎn)以抑菌活性為需求的產(chǎn)品則無需考慮其分子量的影響，而若以抗氧化活性為功效需求，則可選擇活性相對較高的HCP-H。