王建榮 李阿麗 汪寶堆

摘要：采用一鍋式仿生礦化法形成轉(zhuǎn)化酶@ZIF-8，并通過羧甲基纖維素改性，改變ZIF-8的分散性。用血糖儀檢測轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖產(chǎn)生的葡萄糖濃度，從而實現(xiàn)了對癌細胞的診斷。在形成ZIF-8的過程中，轉(zhuǎn)化酶的加入大大縮短了ZIF-8的形成時間，而且轉(zhuǎn)化酶與Zn2+之間有靜電作用，加速了生物礦化過程。通過對羧甲基纖維素（CMC）的修飾，羧甲基纖維素與ZIF-8之間存在靜電作用，改變了英威騰酶@ZIF-8的分散性。重要的是，這是第一次CMC改變了ZIF-8在生物仿生礦化過程中的穩(wěn)定性和分散性，并被用于便攜式血糖儀對癌細胞的早期診斷。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們證明這種方法適用于檢測不同數(shù)量的癌細胞，表明我們制備的Invertase@ZIF-8@CMC可以用于便攜式血糖儀的癌癥早期診斷。

1.前言

最近，MOFs封裝的蛋白質(zhì)的仿生礦化引起了人們的極大興趣。由于其仿生礦化的封裝結(jié)構(gòu)，它們可以增強蛋白質(zhì)的活性，提高其在各種變性條件下的穩(wěn)定性。同時，生物樣本和實際血液樣本可以被長期保存。保證了實際生物樣本、血樣的運輸，并保持其生物活性，解決了生物活性和運輸?shù)膯栴}，具有良好的研究意義。然后，仿生礦化MOFs封裝的蛋白質(zhì)在穩(wěn)定性和分散性方面仍然存在挑戰(zhàn)。MOFs已經(jīng)被應(yīng)用于各種有價值的材料，包括氣體儲存、催化和吸附分離。本文選擇了低細胞毒性和可生物降解的MOFs。沸石咪唑骨架-8（ZIF-8），由Zn2+和2-甲基咪唑（2-HmIm）之間的配合形成。通過精細控制2-HmIm與Zn2+的濃度比，我們引入了一種簡單的一鍋式仿生礦化方法來合成納米級MOFs，以封裝高負荷蛋白質(zhì)。

2.實驗

2.1材料

六水硝酸鋅（Zn（NO3）2-6H2O）購自成都科隆化學(xué)試劑廠。羧甲基纖維素（CMC）購自Macklin，N， N-二甲基甲酰胺（DMF）、氯仿（CHCl3）、乙醇（C2H5OH）、冰醋酸（CH3COOH）購自利安隆博華（天津）藥物化學(xué)有限公司。蔗糖、Na2HPO4、麥芽糖和CH3COONa購自天津廣福精細化工研究所。D-葡萄糖、D-果糖購自上海三友試劑廠。過氧化氫（H2O2，30%）購自四川西橋化工股份有限公司。

2.2實驗過程

將5 mL 40 mM （0.5268 g） Zn（NO3）2-6H2O和5 mL 160 mM （1.576 g） 2-HmIm加入到20 mL玻璃瓶中，并將混合物放置24小時。最后，對混合物進行離心洗滌，并進行干燥，得到ZIF-8的白色粉末。稱取60.9毫克的羧甲基纖維素鈉，加入到30毫升的蒸餾水中并充分攪拌。加入兩滴濃鹽酸，將混合物磁力攪拌并保持24小時。最后，將反應(yīng)混合物對著透析袋透析三天，直到溶液的pH值為中性，收集溶液并儲存起來以備后。將80毫克的Invertase加入到5毫升的40mM（0.5268克）Zn（NO3）2-6H2O中并充分攪拌后，將5毫升的160mM（1.576克）的2-HmIm加入到上述混合物中，然后將混合物放置5分鐘。最后，將得到的混合物離心洗滌，并干燥，得到Invertase@ZIF-8白色粉末。稱出20毫克Invertase@ZIF-8白色粉末，加入10毫升10%的CMC-COOH溶液中，在室溫下磁力攪拌24小時。最終得到Invertase@ZIF-8@CMC溶液。取10mL制備好的Invertase@ZIF-8@CMC溶液，然后加入100uL活化的FA-NH2溶液，將混合物在室溫下暗中攪拌24小時。最后得到Invertase@ZIF-8@CMC@FA溶液，并在黑暗中保存以備將來實驗使用。

3結(jié)果和討論

3.1材料的合成和表征

用SEM和TEM來表征ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC的形貌。如圖1所示，分別是ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC的SEM和TEM圖像。從圖1a，1d可以看出，Zn2+和2-甲基咪唑（2-HmIm）之間的配位形成的ZIF-8是一個十二面體的形狀。從圖1b、1e可以看出，通過仿生礦化過程形成的Invertase@ZIF-8可以保持ZIF-8的形態(tài)，而加入蔗糖酶可以明顯縮短ZIF-8的形成時間。從圖1c和1f可以看出，羧甲基纖維素（CMC）被涂在ZIF-8的表面。

3.2如圖2a所示，ZIF-8和模擬ZIF-8的XRD特征衍射峰圖譜完全一致。ZIF-8的XRD特征衍射峰（011）、（002）、（112）、（022）、（013）、（222）、（114）、（233）、（134）、（144）。同樣，Invertase@ZIF-8和模擬ZIF-8的XRD特征衍射峰譜也完全一致。解釋Invertase@ZIF-8生物仿生礦化過程的完成。從FT-IR（圖2b）可以看出，Invertase@ZIF-8，1640cm-1代表Zn和蔗糖酶C=0的存在，進一步說明ZIF-8中Invertase的存在。在Invertase@ZIF-8@CMC中，我們可以看到1600 cm-1和2445 cm-1的強吸收帶，表明纖維素（CMC）中存在-COO-功能團。在Invertase@ZIF-8@CMC@FA的紅外圖像中，1670 cm-1對應(yīng)于葉酸（FA）中存在的-NH2-功能團。如圖2c所示，Invertase@ZIF-8@CMC的熱重分析經(jīng)歷了幾個階段的重量損失。在25-270℃的溫度范圍內(nèi)，Invertase的第一次損失是由于吸附的水的分解。在270-340℃的溫度范圍內(nèi)的第二次失重對應(yīng)于英威騰酶的分解，在340℃后失重基本保持不變，表明英威騰酶的分解幾乎已經(jīng)完成。ZIF-8在25-160℃溫度范圍內(nèi)的第一次損失是由于吸附的水的分解。在160-233℃的溫度范圍內(nèi)的第二次失重與結(jié)合水的分解有關(guān)。在233-800℃的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的第三次失重與ZIF-8的分解有關(guān)，同時結(jié)構(gòu)塌陷。從圖2c可以看出，Invertase@ZIF-8和ZIF-8的熱分解趨勢和分解溫度是一樣的，Invertase@ZIF-8的分解趨勢更加明顯。通過比較ZIF-8和Invertase@ZIF-8在270-340℃時的最大分解，在這個溫度下正好對應(yīng)于Invertase的分解，我們可以發(fā)現(xiàn)Invertase的負載為10wt%。

如圖3a所示，ZIF-8的比表面積（BET）為1376.4m2/g，而Invertase@ZIF-8的比表面積（BET）為989.2m2/g。我們發(fā)現(xiàn)，加入Invertase后，比表面積比原來的ZIF-8減少了387.2 m2/g，Invertase進入ZIF-8并占據(jù)其孔隙，導(dǎo)致BET的下降。如圖3b所示，從紫外-可見光譜可以看出，ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC都沒有明顯的紫外吸收峰，但在Invertase@ZIF-8@CMC@FA中，在279nm和345nm處有明顯的吸收。在345納米處有一個明顯的葉酸紫外吸收峰，進一步表明材料中存在葉酸（FA）。我們之前已經(jīng)證明了葉酸在紅外線中存在一個-NH2-功能團。

3.3敏感地檢測癌細胞，用于癌癥的早期診斷

在應(yīng)用前評估了Invertase@ZIF-8@CMC的細胞毒性活性，并用于癌細胞檢測。用Invertase@ZIF-8@CMC培養(yǎng)細胞活力，HeLa細胞的Invertase@ZIF-8@CMC在48小時內(nèi)保持在30微克/毫升，表明Invertase@ZIF-8@CMC@FA的細胞毒性低。為了證明該探針的潛在臨床用途，該傳感器還被用于檢測全血中的HeLa細胞。如圖5a所示，血糖儀讀數(shù)的變化隨著Invertase@ZIF-8@CMC濃度的變化而變化。我們測試了HeLa細胞（過量表達葉酸受體）和葉酸受體表達不足的NIH3T3細胞來表征Invertase@ZIF-8@CMC的性能。將Invertase@ZIF-8@CMC@FA培養(yǎng)一小時。然后用PBS緩沖液清洗細胞，以去除不粘附在細胞表面的物質(zhì)，并加入蔗糖溶液進行反應(yīng)。如圖5b所示，相同數(shù)量的HeLa和NIH3T3細胞的血糖儀讀數(shù)的變化。這一結(jié)果清楚地表明，通過葡萄糖濃度的變化可以很容易地識別出FA陽性的癌細胞和正常細胞之間的差異。如圖6c所示，用Invertase@ZIF-8@CMC培養(yǎng)不同數(shù)量的HeLa細胞。隨著細胞數(shù)量的增加，血糖儀所測得的PGM讀數(shù)不斷增加，并顯示出良好的線性相關(guān)性。因此，這種血糖儀檢測葡萄糖濃度變化的檢測平臺對于高靈敏度和快速的早期癌癥診斷是非常理想的，在臨床和護理點有潛在的應(yīng)用，在生物醫(yī)學(xué)和癌癥診斷方面有重要的應(yīng)用前景。

4.結(jié)論

綜上所述，制備的分散性Invertase@ZIF-8@CMC被應(yīng)用于便攜式血糖儀的癌癥早期診斷。Invertase@ZIF-8是通過一鍋式仿生物礦化法形成的。生物相容性的羧甲基纖維素（CMC）涂層改變了ZIF-8的分散性，提供了良好的穩(wěn)定性和分散性。形成的Invertase@ZIF-8還顯示出優(yōu)良的蛋白質(zhì)活性和保護蛋白質(zhì)免受酶介導(dǎo)的降解。此外，Invertase@ZIF-8@CMC@FA首先與癌細胞上的葉酸受體發(fā)生作用。我們使用便攜式血糖儀檢測蔗糖水解產(chǎn)生葡萄糖的酶促作用。我們提供了一種合成分散性Invertase@ZIF-8@CMC材料的新方法，其合成路線簡單，成本低，便于攜帶，靈敏度高，并能識別不同的癌細胞，用于癌癥早期臨床癥狀的診斷。因此，它可以作為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床領(lǐng)域的候選材料。

* 通信作者：汪寶堆（1968-）， 男，漢，甘肅定西人，教授，博士 ，Email：wangjr_123@163.com，研究方向為生物。