姚成杰，劉佳珺，林振烔，王藝?yán)?/p>

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建省水產(chǎn)生物育種與健康養(yǎng)殖工程研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

紅螯光殼螯蝦(Cheraxquadricarinatus)，原產(chǎn)于澳大利亞，屬于甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)擬河蝦科(Parastacidae)，為我國20世紀(jì)90年代引進(jìn)的淡水蝦類。由于食性廣、生長快、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的喜愛[1]。已有研究表明，導(dǎo)致養(yǎng)殖生物免疫抗病能力降低的主要原因是環(huán)境因子變化[2]。其中，水溫作為影響蝦蟹等甲殼類動(dòng)物生存最重要的環(huán)境因子之一，不僅直接影響其代謝、生長、蛻殼和存活等[3-5]，而且還會(huì)影響鹽度、溶氧量等環(huán)境因子。

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一類高度保守的細(xì)胞蛋白家族[6]。按分子質(zhì)量大小可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP和泛素等6個(gè)家族[7]。其在環(huán)境脅迫因子(高溫、重金屬和微生物感染等)刺激下表達(dá)量顯著升高[8-10]。HSP70是HSP家族蛋白中含量最多的熱應(yīng)激蛋白，該蛋白廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，并扮演著“守衛(wèi)者”的角色，其功能主要是參與和調(diào)控蛋白質(zhì)的折疊修飾[11]，在應(yīng)激等不利條件下，提高細(xì)胞的抵抗力，起到應(yīng)激保護(hù)作用。研究表明，HSP70可通過降解異常蛋白促進(jìn)蛋白的正確重折疊而在應(yīng)對熱脅迫時(shí)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[12-13]。

研究熱應(yīng)激本質(zhì)及HSPs的作用機(jī)理，對于動(dòng)物生產(chǎn)和繁殖有著非常深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。近年來，水生動(dòng)物體在熱應(yīng)激過程中HSPs的表達(dá)變化相繼被報(bào)道，例如有西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)[14]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[15]、銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[16]。相較于克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)[17]和鋸緣青蟹(Scyllaserrata)[18]等水生無脊椎動(dòng)物，紅螯光殼螯蝦的相關(guān)研究較少。

本實(shí)驗(yàn)以紅螯光殼螯蝦為研究對象，在NCBI上獲取Hsp70(KR058821.1)基因序列的基礎(chǔ)上，分析其結(jié)構(gòu)特征，研究其在高溫應(yīng)激下鰓、肝胰腺和血淋巴中的表達(dá)變化，以期為研究紅螯光殼螯蝦熱應(yīng)激過程中的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)，有助于螯蝦養(yǎng)殖者理解熱應(yīng)激的生理變化、評估熱應(yīng)激的不利影響并做好熱應(yīng)激預(yù)防。

1 材料與方法

1.1 材料

紅螯光殼螯蝦取自廈門市紀(jì)雄水產(chǎn)有限公司，體長(13.03±0.43)cm，體重(80.69±0.56)g，于本實(shí)驗(yàn)室28 ℃的淡水養(yǎng)殖缸中暫養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高溫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

對照組以紅螯光殼螯蝦生長溫度(26～30 ℃)的中間溫度(28 ℃)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，高溫組設(shè)定為34 ℃和36 ℃。觀察到紅螯光殼螯蝦的生長狀況為：28 ℃下20尾蝦生長均良好，活力較好；34℃應(yīng)激下，20尾蝦在初始一段時(shí)間反應(yīng)大，躲避反應(yīng)較為頻繁，24 h之后活力有所恢復(fù)，48 h有30%的蝦死亡；36 ℃應(yīng)激下，20尾蝦在24 h內(nèi)全部死亡。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及活力觀察，最終確定以34 ℃進(jìn)行高溫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。

將28 ℃下暫養(yǎng)的紅螯光殼螯蝦分為2組，分別設(shè)為對照組和實(shí)驗(yàn)組。對照組水溫為28 ℃，于0 h 取樣。實(shí)驗(yàn)組水溫為34 ℃，于6 h、12 h、48 h和72 h取樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取6尾蝦，共24尾。每尾蝦取其血細(xì)胞、鰓和肝胰腺，放入RNA later溶液后保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于RNA的提取。

1.2.2 熱休克及免疫相關(guān)基因定量引物設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)所用的Hsp70基因和內(nèi)參基因β-actin定量引物通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，所有引物依托廈門鉑瑞生物科技有限公司合成。各引物及其序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2.3 總RNA的提取及cDNA模板制備

用EastepTMSuper總RNA試劑盒提取紅螯光殼螯蝦鰓、肝胰腺和血淋巴3個(gè)組織5個(gè)時(shí)相(對照組0 h；實(shí)驗(yàn)組6，12，48，72 h)的RNA，利用紫外分光光度計(jì)和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳來驗(yàn)證RNA的質(zhì)量及完整性。采用Promega公司提供的M-MLV酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備定量用cDNA模板。

1.2.4 目的基因的生物信息學(xué)分析

用Compute pI/Mw tool(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)預(yù)測等電點(diǎn)和分子質(zhì)量；用NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)查找磷酸化位點(diǎn)；采用SignalP 5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)尋找信號(hào)肽；用BioEdit軟件(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)進(jìn)行序列多重比較；用MEGA X軟件(http://www.megasoftware.net/)中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR體系及條件

以紅螯光殼螯蝦的β-actin作為內(nèi)參基因，以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一條鏈為模板。反應(yīng)體系如下：cDNA模板4.5 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5 μL，正/反向定量引物各0.25 μL。包括對照組在內(nèi)的5個(gè)時(shí)相，每個(gè)時(shí)相做6個(gè)樣品。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性15s，60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。

數(shù)據(jù)分析：根據(jù)儀器自動(dòng)給出樣品的RQ值(即2-△△Ct，其中△CT=“樣品目的基因的CT值”減“內(nèi)參基因β-actin的CT值”，△△CT=“每一個(gè)樣品的△CT值”減“基準(zhǔn)樣品的△CT值”)，記錄下RQ值。用RQ的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±standard error，M±SE)表示基因表達(dá)水平。

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t-檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 CqHsp70序列分析

紅螯光殼螯蝦CqHsp70基因Genbank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)為KR058821.1。其核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列見圖1。CqHsp70的開放閱讀框(open reading frame,ORF)1932 bp，編碼氨基酸643個(gè)。使用Compute pI/Mw tool預(yù)測得到理論等電點(diǎn)為5.27，分子質(zhì)量為70.3 ku，5’ UTR 37 bp，3’ UTR 549 bp。該序列預(yù)測含有32個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，39個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)和12個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)。此外，4—598aa為HSP70結(jié)構(gòu)域，序列中并沒有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。

2.2 序列多重比對

多重比對發(fā)現(xiàn)HSP70在不同物種中保守性高(見圖2)。比對中所用的物種和氨基酸序列信息見表2。

2.3 HSP70的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取了16個(gè)不同物種的HSP70氨基酸序列(見表2)。使用MEGA X軟件分析HSP70的進(jìn)化樹。根據(jù)構(gòu)建后得到的HSP70進(jìn)化樹可見：HSP70主要分為脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物兩支，脊椎動(dòng)物分支中包含哺乳動(dòng)物和魚類，無脊椎動(dòng)物分支中包括蝦蟹類和貝類等。紅螯光殼螯蝦HSP70與美洲螯龍蝦(Homarusamericanus)、鋸緣青蟹(Scyllaserrata)及三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)等蝦蟹類的HSP70聚為一支，其與美洲螯龍蝦一致性最高，達(dá)到99%。

表2 HSP70的物種名稱和GenBank登錄號(hào)

2.4 CqHsp70在熱應(yīng)激下的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,對紅螯光殼螯蝦在34 ℃高溫應(yīng)激下的鰓、肝胰腺和血細(xì)胞中的CqHsp70基因表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明：紅螯光殼螯蝦鰓中CqHsp70基因表達(dá)量在6 h時(shí)最低，與對照組差異不顯著；12 h時(shí)該基因表達(dá)量最高，與對照組形成極顯著差異(P<0.01)；之后回落至正常水平(見圖4a)。

在34 ℃高溫應(yīng)激下，紅螯光殼螯蝦肝胰腺中CqHsp70基因表達(dá)量變化趨勢與鰓相同。6 h時(shí)，該基因的表達(dá)量與對照組差異不顯著;12 h時(shí)該基因表達(dá)量最高，與對照組形成顯著差異(P<0.05)；48 h時(shí)已回復(fù)正常表達(dá)水平(見圖4b)。

在34 ℃高溫應(yīng)激下，紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞中CqHsp70基因表達(dá)量在6 h時(shí)已開始上升，但與對照組沒有顯著性差異;12 h時(shí)該基因表達(dá)量最高，與對照組形成極顯著差異；48 h之后表達(dá)量與對照組差異不顯著，已恢復(fù)至正常水平(見圖4c)。

3 討論

3.1 CqHsp70基因的結(jié)構(gòu)特征

HSP70家族在進(jìn)化上是高度保守的，是目前研究最深入的HSP之一，適量HSP70的存在對維持動(dòng)物正常生長發(fā)育是必需的，在提高細(xì)胞對應(yīng)激的耐受性及維護(hù)細(xì)胞自穩(wěn)等方面具有重要的生物學(xué)作用[19]。紅螯光殼螯蝦CqHsp70的cDNA全長2231 bp，5’ UTR 37 bp，3’ UTR 549 bp，可編碼643個(gè)氨基酸，4—598aa為HSP70結(jié)構(gòu)域。CqHsp70預(yù)測含有83個(gè)磷酸化位點(diǎn)，序列含有39個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，32個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)和12個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)。在序列中沒有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，與擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)的HSP70分析結(jié)果一致[20]。HSP70結(jié)構(gòu)域可再分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(ATP酶結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和C端結(jié)構(gòu)域，且具有谷氨酸—谷氨酸—纈氨酸—天冬氨酸(EEVD)的末端特征序列[21]。多重序列比較結(jié)果顯示，紅螯光殼螯蝦HSP70與其他物種蛋白序列在N端ATP酶結(jié)構(gòu)域和底物肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似性很高，在C端結(jié)構(gòu)域保守性有所降低，這符合HSP70的保守性和結(jié)構(gòu)特征[22]。

HSP70在動(dòng)物中廣泛存在。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，HSP70分為兩大支，一大支由脊椎動(dòng)物組成，一大支由無脊椎動(dòng)物組成，與其進(jìn)化地位較一致。紅螯光殼螯蝦的CqHSP70與蝦蟹類的HSP70聚為一支，且相似度較高，并與美洲螯龍蝦的HSP70相似性最高，這表明HSP70蛋白在甲殼動(dòng)物中高度保守。

3.2 CqHsp70基因的表達(dá)

熱應(yīng)激是指當(dāng)環(huán)境溫度超過動(dòng)物舒適溫度(產(chǎn)熱最低點(diǎn)與蒸發(fā)散熱急劇增加起始點(diǎn)之間的溫度)時(shí)，動(dòng)物體為保護(hù)其正常的代謝作用和各種生理機(jī)制所必須做出的各種反應(yīng)的總和[6]。生物體在正常生理?xiàng)l件下有少量的熱休克蛋白存在且表達(dá)量低，其表達(dá)量在受到熱應(yīng)激后會(huì)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)[23]。

作為一種重要的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)因子，HSP70具有修復(fù)應(yīng)激給機(jī)體帶來損害的功能[24]。在大多數(shù)的器官中，應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP70是熱休克蛋白中重要成員之一，當(dāng)受到熱應(yīng)激誘導(dǎo)之后其表達(dá)量會(huì)增加[25]。對大西洋無眼裂縫蝦(Rimicarisexoculata)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，兩個(gè)Hsp70亞型基因表達(dá)量在熱應(yīng)激后分別增加261倍和154倍[26]。擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)的Hsp70基因表達(dá)量在熱應(yīng)激后顯著提高[27]。另外，甲殼類動(dòng)物在熱應(yīng)激后，Hsp70表達(dá)量的升高對保護(hù)機(jī)體起著重要作用。研究表明，短期高溫暫養(yǎng)斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)可增加Hsp70的表達(dá)，減少鰓相關(guān)病毒的復(fù)制[28]。非致死熱休克誘導(dǎo)凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)Hsp70的合成，促進(jìn)其對熱、氨和金屬的耐受性[29]。而采用RNAi技術(shù)敲除Hsp70，會(huì)降低方斑鹵蟲(Artemiafranciscana)幼體對熱和細(xì)菌感染的耐受性[30]。

本實(shí)驗(yàn)選擇鰓、肝胰腺和血液這三個(gè)蝦蟹重要免疫器官對Hsp70基因表達(dá)量變化進(jìn)行分析，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，CqHsp70基因在紅螯光殼螯蝦的鰓、肝胰腺、血細(xì)胞中均有表達(dá)。尤其是在血細(xì)胞中表達(dá)水平最高，其次是在肝胰腺中，而在鰓中表達(dá)水平最低。這說明紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞是CqHsp70發(fā)揮其抗應(yīng)激作用的重要部位。

高溫應(yīng)激初始階段(6 h內(nèi))，紅螯光殼螯蝦血細(xì)胞中CqHsp70基因表達(dá)上調(diào)，這可能是因?yàn)檠?xì)胞中的CqHsp70基因作為重要細(xì)胞保護(hù)因子較早發(fā)揮作用。隨著應(yīng)激時(shí)間的延長，血細(xì)胞、肝胰腺和鰓中的CqHsp70基因的表達(dá)在12 h達(dá)到高峰。說明此時(shí)CqHsp70在應(yīng)激防御中起著不可替代的重要作用，也說明高溫應(yīng)激后的12 h是紅螯光殼螯蝦調(diào)控?zé)釕?yīng)激的關(guān)鍵點(diǎn)，在夏天高溫季節(jié)的養(yǎng)殖過程中應(yīng)特別加以注意。