包玉龍

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

APAP具有止痛和解熱特性，是最常用的藥物之一。推薦劑量下，安全有效，而過量可能導(dǎo)致急性藥物性肝損傷(DILI)[1]。實(shí)際上，APAP引起的肝損傷是許多國家DILI的最主要原因，占美國所有肝損傷病例的近50%和英國的60%[2-3]。盡管通常可以通過停止服用APAP來改善，但在某些情況下，嚴(yán)重APAP所致肝損傷可以致命[4]。

人類肝臟包含多達(dá)1010個常駐淋巴細(xì)胞[5],由B細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷(NK)、自然殺傷T(NKT)細(xì)胞組成。NK/NKT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的病理作用已經(jīng)使用APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠模型進(jìn)行了深入研究[6]。淋巴細(xì)胞募集，炎癥增加，炎癥的性質(zhì)和程度決定了損傷的進(jìn)展和嚴(yán)重程度，同時，DILI與淋巴細(xì)胞浸潤有關(guān)。然而，這些細(xì)胞在損傷發(fā)病機(jī)制中的確切作用仍存在爭議[7]。目前，關(guān)于肝巨噬細(xì)胞的作用，已經(jīng)證明這些細(xì)胞通過產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β和一氧化氮，促進(jìn)APAP誘導(dǎo)肝毒性。肝巨噬細(xì)胞還通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和介質(zhì)（如IL-10、IL-6和IL-18結(jié)合蛋白）發(fā)揮保肝作用，這些蛋白可以對抗炎癥事件并促進(jìn)肝臟再生[8]。與巨噬細(xì)胞一樣，中性粒細(xì)胞也會在組織損傷后清除細(xì)胞碎片。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對控制自身反應(yīng)性T細(xì)胞和緩解炎癥具有重要的意義。它們能夠維持穩(wěn)定的慢性炎癥并防止爆發(fā)性組織破壞。肝內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率和功能影響慢性病毒性肝炎和肝損傷的結(jié)果，肝臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的募集和存活之間的平衡可能決定DILI的結(jié)果[9-11]。然而，以往的研究多數(shù)都局限在肝臟損傷過程中的某一個時相中，目前對于APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中的各類免疫細(xì)胞的動態(tài)變化尚未見報道。因此研究對APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中代謝時相、損傷時相和修復(fù)再生時相中固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的動態(tài)變化情況具有重要的臨床指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步揭示APAP急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。選擇6周齡的雄性C57BL/6野生型小鼠作為實(shí)驗動物，購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑。APAP（Sigma,美國），ALT、AST ELISA試劑盒（南京建城生物有限公司）,TNF-α和IL-1 ELISAELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司),FITC-F4/80、PE-NKp46、APC-CD11c、FITC-CD3、PE-CD4、APC-CD8和Cy7-CD25流式抗體（Abcam,美國）,DAB試劑盒、HE染色試劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.1.3 儀器。智能型高效離心機(jī)(Beckman Coulter,美國),超純水制造系統(tǒng)(四川優(yōu)普超純科技有限公司),流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,美國),酶標(biāo)儀（Bioteck,美國）,倒置顯微鏡(Nikon,日本),切片機(jī)、包埋機(jī)、攤烤片機(jī)(Leica,德國)。

1.1.4 培養(yǎng)基。RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma,美國)。

1.2 方法

1.2.1 急性肝損傷模型的構(gòu)建。將雄性C57BL/6野生型小鼠在可控的室溫下飼養(yǎng)，溫度25±2℃，相對濕度55%±10%，進(jìn)行12 h的明暗循環(huán)。將70只小鼠隨機(jī)分為2大組：對照組，模型組。模型組分為損傷后1、2、3、5、7、14、21 d為時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)有對照組5只，模型組5只。向模型組腹膜內(nèi)注射APAP溶液（200 mg/kg），引起急性肝損傷。建模后的每個時間點(diǎn)，在小鼠中進(jìn)行異氟烷麻醉，從眼球收集血液并解剖肝臟。在解剖前，確保小鼠停止進(jìn)食12 h時并自由飲食。

1.2.2 ELISA法檢測生物化學(xué)指標(biāo)。將血樣在4℃下凝結(jié)，并在3000 g離心15 min后從血樣中分離血清樣品，-20℃保存，用于ELISA檢測。

使用南京建城生物有限公司ELISA試劑盒，檢測血清中ALT和AST的水平，以反映ALT和AST的活性。

使用南京建城生物有限公司ELISA試劑盒檢測ALT、AST；使用江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司ELISA試劑盒檢測TNF-α和IL-1，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。在測定樣品前需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.25 pg/mL、15.625 pg/mL濃度，各取100μL待測血清加到96孔板內(nèi)，每孔重復(fù)3次，在室溫下孵育3 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm測定光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清ALT、AST、TNF-α和IL-1的含量。

1.2.3 HE染色。將切除的肝組織切成適當(dāng)?shù)拇笮。?%多聚甲醛固定，固定后石蠟包埋，將包埋后的組織切成4μm厚度，脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織。

1.2.4 流式檢測免疫細(xì)胞。取小鼠的相同肝葉，將其放入含1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。用注射器塞子在200目過濾器上擠壓肝臟以獲得細(xì)胞懸液。將獲得的細(xì)胞懸液連續(xù)過濾到帶有200目的過濾器的15 ml離心管中，并以1000 r/min離心8 min。密封后，分別加入FITC-F4/80、PE-NKp46、APC-CD11c、PE-CD4、APC-CD8和Cy7-CD25抗體，在4℃下在黑暗中孵育30 min，離心收集細(xì)胞，重懸于PBS中,并上機(jī)檢測。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析。試驗數(shù)據(jù)以5只實(shí)驗動物的平均值±SD表示,采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過單因素方差分析進(jìn)行分析，并進(jìn)行Tukey檢驗，以檢驗各種處理之間的顯著差異,P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠血清ALT、AST表達(dá)水平變化

ELISA法檢測血清中ALT、AST表達(dá)水平，從圖1可以看出，與對照組Con相比，高劑量APAP處理小鼠第1d時，小鼠血清中ALT、AST水平升高并已達(dá)到峰值（ALT為372.71±1.58 U/L；AST為143.78±13.81 U/L），從APAP處理第2d，ALT、AST表達(dá)水平明顯下降（ALT為106.03±21.42 U/L；AST為20.10±2.27 U/L），在APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷后第3~14日ALT、AST水平與對照組無差異（對照組：ALT為8.37±1.78 U/L，AST為13.18±3.67 U/L；第14d ALT為9.84±3.15 U/L，AST為9.61±0.97 U/L）（見圖1）。表明APAP誘導(dǎo)的肝損傷模型成功。

圖1 ALT、AST表達(dá)變化情況

2.2 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中組織病理學(xué)變化

利用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理改變，病理檢測圖片如圖2所示。從圖中可以看出，APAP處理2 d肝門靜脈區(qū)1/3以上面積的肝細(xì)胞凝固型壞死。APAP處理5 d，損傷修復(fù)區(qū)肝靜脈至肝血竇軸系上可見大量炎性細(xì)胞浸潤，炎癥可造成肝損傷修復(fù)后炎癥的持續(xù)性損傷。APAP處理7 d炎癥消退，肝組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，只是在少量靜脈區(qū)還存在一定的炎細(xì)胞浸潤（見圖2）。上述結(jié)果表明，APAP誘導(dǎo)的肝損傷第7日已基本完成肝損傷修復(fù)。

圖2 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷中組織病理學(xué)變化

2.3 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中炎癥因子表達(dá)變化

ELISA法檢測血清中IL-1β、TNF-α的含量，從圖3可以看出，IL-1β對照組含量為37.21±0.25，TNF-α對照組為234.2±12.02。高劑量APAP處理小鼠第2 d時，小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平顯著升高，IL-1β升高至82.44±6.40，TNF-α為345.51±39.79（P＜0.05），在之后5d、7d、14d仍維持較高的水平（P＜0.05）（見圖3A、B）。表明IL-1β、TNF-α在肝損傷及肝損傷修復(fù)中起著主要的作用。

圖3 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷中炎癥因子表達(dá)變化

2.4 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中固有免疫細(xì)胞動態(tài)變化

流式細(xì)胞術(shù)法測定肝臟組織中的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞含量，從圖4可以看出，與對照組相比（NK細(xì)胞數(shù)量254±22.11，巨噬細(xì)胞數(shù)量356.33±31.89），高劑量APAP處理小鼠第3日時，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞水平顯著升高（NK細(xì)胞數(shù)量1353±50.76，巨噬細(xì)胞數(shù)量4640±122.87）（P＜0.05），從APAP處理第5日，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞明顯下降（NK細(xì)胞數(shù)量547±172.81，巨噬細(xì)胞數(shù)量1063.33±221.22），并與對照組無明顯差異。而樹突細(xì)胞在APAP處理小鼠第2日顯著升高，對照組樹突細(xì)胞數(shù)量為3049.66±200.4，第2日為4532.43±187.54；從第3日開始明顯下降，第5日時（1577±312.78）與對照組比較差異顯著（P＜0.05）。表明NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的數(shù)量在肝損傷及肝損傷修復(fù)過程中發(fā)生顯著的變化。

圖4 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中固有免疫細(xì)胞動態(tài)變化

2.5 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中適應(yīng)性免疫細(xì)胞動態(tài)變化

流式細(xì)胞術(shù)法測定肝臟組織中成熟T淋巴細(xì)胞含量，從圖5可以看出，與對照組相比，高劑量APAP處理小鼠第5日時，CD3+成熟T細(xì)胞、輔助性CD3+CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P＜0.05），第7日仍處于較高狀態(tài)，與對照組有顯著差異（P＜0.05），第14日已降低，與對照組無差異。而對于抑制性CD3+CD8+T細(xì)胞而言，高劑量APAP處理小鼠第3 d時，細(xì)胞數(shù)量顯著升高（132.5±16.74）（P＜0.05），第5日和第7日仍處于較高狀態(tài)，與對照組（33±7.21）有顯著差異（P＜0.05），第14日已降低（56.67±4.18），與C無差異。表明，抑制性CD3+CD8+T和CD3+成熟T細(xì)胞、輔助性CD3+CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝臟修復(fù)不同時相產(chǎn)生動態(tài)變化。

圖5 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中適應(yīng)性免疫細(xì)胞動態(tài)變

3 討論

肝臟是人體藥物代謝的場所，容易受到藥物代謝損傷，近年來藥物導(dǎo)致的肝損傷備受關(guān)注。APAP是臨床廣泛運(yùn)用的陣痛解熱藥物，APAP過量是急性肝功能衰竭的最常見原因之一[12]。APAP所致肝損傷的時相分為三個階段，代謝時相，損傷時相和修復(fù)再生時相[13]。本文主要探討三個時相中，先天免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、樹突細(xì)胞、炎癥因子發(fā)揮的作用。

APAP肝損傷模型是一種顯著臨床相關(guān)性的藥物肝損傷模型[14]，在APAP肝損傷模型中，AST和ALT絕大部分分布在肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝臟受損時，肝細(xì)胞膜破壞，AST和ALT進(jìn)入血液，血液中AST和ALT水平升高[15]。本研究APAP處理后24 h，血清中ALT、AST水平升高并達(dá)到峰值，APAP組小鼠肝臟損傷明顯，表面有點(diǎn)狀充血、變性和壞死，說明造模成功。

從本實(shí)驗HE圖看出，肝臟第2日，第5日肝臟損傷，處于損傷時相，期間TNF-α、IL-1β升高，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞第2日升高，第3日開始降低，CD3+成熟T細(xì)胞、輔助性CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞從第5日升高。HE圖中肝臟第7日肝臟狀態(tài)與對照相當(dāng)，處于修復(fù)再生時相，期間TNF-α、IL-1β仍處于較高狀態(tài)，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞降低；CD3+成熟T細(xì)胞、輔助性CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞仍處于較高狀態(tài)。IL-1β是巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物，有研究發(fā)現(xiàn)[16-19]，APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，IL-1β主要依賴NK細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α所誘導(dǎo)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的急性肝損傷。同時，肝臟巨噬細(xì)胞的作用一直在爭議之中。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)APAP處理后巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞在第3日顯著增加，隨后下降，樹突細(xì)胞在處理后的第2日明顯升高。也有研究表明[20]，樹突狀細(xì)胞耗竭也加劇了對乙酰氨基酚的肝毒性。從本實(shí)驗中也能夠看出，樹突細(xì)胞在損傷后第2日后開始急劇下降，肝臟損失嚴(yán)重。

研究還發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞可以通過殺傷非成熟的DC和分泌促炎癥因子，促進(jìn)T細(xì)胞的活化并能招募免疫細(xì)胞到達(dá)感染部位[21-22]。本實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，成熟T細(xì)胞總數(shù)在5日開始急劇的增加，在第7日達(dá)到最高峰后，在14日時又恢復(fù)到對照組的水平。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對控制自身反應(yīng)性T細(xì)胞和緩解炎癥很重要，它們維持穩(wěn)定的慢性炎癥并防止爆發(fā)性組織破壞[17]。由此可以看出，在APAP急性肝損傷過程中，在損傷早期固有免疫細(xì)胞在炎性損傷中發(fā)揮重要作用，而在損傷修復(fù)期由成熟T細(xì)胞發(fā)揮主要作用。但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

高劑量APAP處理小鼠后，血清中ALT、AST水平升高，肝細(xì)胞損傷。在APAP肝臟損傷不同時相中，固有免疫、適應(yīng)性免疫發(fā)揮著不同的作用。壞死的肝細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-1β、TNF，在肝損傷修復(fù)期仍處于較高狀態(tài)；同時固有免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞在損傷時相升高，修復(fù)再生時相降低至正常水平；T細(xì)胞發(fā)生動態(tài)變化，在損傷時相和修復(fù)再生時相處于升高狀態(tài)，14日后降低至正常狀態(tài)。本研究證實(shí)了肝損傷過程中，免疫因子、固有免疫細(xì)胞、適應(yīng)性免疫細(xì)胞在肝損傷修復(fù)中的動態(tài)變化，并長時間觀察了APAP肝損傷的修復(fù)過程，但具體的關(guān)聯(lián)性仍需要進(jìn)一步探索。