汪靜皎，黃丹丹，楊樹東，蔡 穎，郭 慶，周志毅

早期分化型胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低，更適合內(nèi)鏡治療[1-2]。然而，早期分化型胃癌中存在較大的異質(zhì)性，部分仍存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險[3-4]，需要尋找新的相關(guān)評估指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，部分胃分化型腺癌具有腸母細(xì)胞表型(包括SALL4、AFP、GPC3等)，并有高侵襲生物學(xué)行為，更易發(fā)生脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[5-7]。目前，分化型早期胃癌的腸母細(xì)胞表型與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，及其在內(nèi)鏡切除術(shù)適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中的臨床意義尚不清楚。本文采用免疫組化EnVision法檢測200例分化型早期胃癌中的腸母細(xì)胞表型，探討腸母細(xì)胞表型與分化型早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及內(nèi)鏡切除術(shù)適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系，分析其作為預(yù)測分化型早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移指標(biāo)的實用性。

1 材料與方法

1.1 材料收集2008年8月～2020年4月南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的200例分化型早期胃腺癌標(biāo)本，包括患者年齡、性別、腫瘤部位及大小、侵犯深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管侵犯及HER-2表達(dá)(140例有HER-2表達(dá)數(shù)據(jù))。

1.2 免疫組化采用免疫組化EnVision法染色，一抗鼠抗人SALL4抗體(1 ∶100)、GPC3抗體(1 ∶100)、AFP抗體(1 ∶100)、D2-40抗體(1 ∶100)，HER-2單抗(4B5)；DAB顯色。HER-2單抗購自美國Ventana Medical Systems公司，其余抗體均購自北京中杉金橋公司。

SALL4表達(dá)定位于胞核，AFP定位于胞質(zhì)，GPC3和D2-40定位于胞膜和胞質(zhì)。腸母細(xì)胞標(biāo)志物評估參考文獻(xiàn)[5]，使用3級評分系統(tǒng)：癌細(xì)胞不表達(dá)為陰性；1%～49%癌細(xì)胞陽性為局灶陽性；≥50%癌細(xì)胞陽性為彌漫陽性。胃癌腸母細(xì)胞表型判讀標(biāo)準(zhǔn)：(1)SALL4彌漫陽性；(2)GPC3或AFP至少呈局灶陽性。滿足上述任一條件者歸為腸母細(xì)胞表型組；不符合上述任一條件，但SALL4局灶陽性者，歸為部分腸母細(xì)胞表型組；三者均陰性者歸為非腸母細(xì)胞表型組。使用Ruschoff/Hofmann法對HER-2染色進(jìn)行評分[8]。用D2-40標(biāo)記淋巴管侵犯。

1.3 內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)[9-12]進(jìn)行判斷。(1)絕對切除標(biāo)準(zhǔn)：黏膜內(nèi)分化型腺癌，無潰瘍，直徑≤2 cm；(2)擴(kuò)展切除標(biāo)準(zhǔn)：①Ex-1：黏膜內(nèi)分化型腺癌，無淋巴血管侵犯(lymphovascular invasion, LVI)，有潰瘍，直徑≤3 cm；②Ex-2：黏膜內(nèi)分化型腺癌，無LVI，無潰瘍，大小不限；③Ex-3：黏膜內(nèi)未分化型腺癌，無LVI，直徑≤2 cm；④Ex-SM1：黏膜下層分化型腺癌，直徑≤3 cm，侵犯深度≤500 μm。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間差異比較使用χ2檢驗或Fisher精確概率法。使用Logistic單因素和多因素回歸分析與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的危險因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分化型早期胃腺癌中SALL4、GPC3、AFP的表達(dá)本組200例分化型早期胃腺癌中有18例SALL4陽性，其中10例呈彌漫陽性，8例呈局灶陽性；GPC3和AFP陽性者分別有4例和1例，均為局灶陽性(圖1)。其中1例SALL4及GPC3同時陽性，另有1例SALL4及AFP同時陽性。本組13例歸為腸母細(xì)胞表型組，8例歸為部分腸母細(xì)胞表型組，合計21例具有腸母細(xì)胞表型，占總例數(shù)的10.5%(21/200)；179例歸為非腸母細(xì)胞表型組。

2.2 腸母細(xì)胞表型的組織學(xué)形態(tài)及其與臨床病理特征的關(guān)系具有腸母細(xì)胞表型病例的組織學(xué)形態(tài)示癌細(xì)胞呈管狀、篩狀或乳頭狀結(jié)構(gòu)，癌細(xì)胞核呈中～高度的異型性，胞質(zhì)多為嗜酸性；其中1例表現(xiàn)為伴腸母細(xì)胞分化的胃癌，癌細(xì)胞具有透明或空泡狀的胞質(zhì)(圖2A)，其余20例缺乏可識別性的形態(tài)學(xué)特征(圖2B)。

腸母細(xì)胞表型與臨床病理特點的關(guān)系：具有腸母細(xì)胞表型與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)；腸母細(xì)胞表型組中位于上部胃者較少，潰瘍形成比率更高，腸母細(xì)胞表型組的HER-2過表達(dá)比例比非腸母細(xì)胞表型組高(P=0.047)；具有腸母細(xì)胞表型(包括腸母細(xì)胞表型組和部分腸母細(xì)胞表型組)出現(xiàn)黏膜下層侵犯、淋巴管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頻率高于非腸母細(xì)胞表型組，而前兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 早期分化型胃腺癌的具有腸母細(xì)胞表型與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 分化型早期胃腺癌的臨床病理與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性經(jīng)單因素分析顯示，患者性別、年齡和潰瘍形成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。腸母細(xì)胞表型組和部分腸母細(xì)胞表型組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分別為76.9%(10/13)和75.0%(6/8)，均高于非腸母細(xì)胞表型組(23/179，12.8%)。前兩者合計16例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，占比76.2%(16/21)；前兩組之間差異無顯著性(P=0.920)。本組上部胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低于中部和下部胃癌，中部和下部胃癌患者之間差異無顯著性。此外，腫瘤大小和淋巴管侵犯也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系(P<0.05,表2)。

表2 早期分化型胃腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理特征的關(guān)系

將單因素分析中與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的6個因素(腸母細(xì)胞表型、腫瘤部位、大小、侵犯深度、淋巴管侵犯及HER-2表達(dá))納入多因素分析，結(jié)果顯示：具有腸母細(xì)胞表型、淋巴管侵犯及HER-2過表達(dá)是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立高危因素(表3)。

表3 多因素分析與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的變量因素

2.4 早期分化型胃腺癌中具有腸母細(xì)胞表型與內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系200例早期分化型胃腺癌：(1)腸母細(xì)胞表型組：13例中有11例不符合內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)，占該組的84.6%(11/13)；2例符合擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)，但已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。(2)部分腸母細(xì)胞表型組：8例中有7例不符合內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)，占該組的87.5%(7/8)；1例符合擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)，但已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。(3)非腸母細(xì)胞表型組：179例中有91例不符合內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)，占該組病例的50.8%(91/179)；88例符合切除標(biāo)準(zhǔn)，僅1例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，具有腸母細(xì)胞表型病例中不符合內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)者比率高于非腸母細(xì)胞表型者(χ2=0.002)；同時，在符合內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)的具有腸母細(xì)胞表型者，比非腸母細(xì)胞表型者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=0.001)。符合擴(kuò)展內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者有4例，侵犯深度均為T1b(SM1)，其中3例均具有腸母細(xì)胞表型(占75%，表4)。因此，腸母細(xì)胞表型應(yīng)提高相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，可以避免給予內(nèi)鏡治療而導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶殘留的臨床風(fēng)險。

表4 4例符合擴(kuò)展內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腸母細(xì)胞表型的臨床病理特征

①A①B①C②A②B圖1 早期分化型胃腺癌中腸母細(xì)胞表型:A.SALL4呈陽性;B.GPC3呈局灶陽性;C.AFP呈局灶陽性,EnVision法 圖2 A.具有腸母細(xì)胞表型的組織學(xué)形態(tài):伴腸母細(xì)胞分化的胃癌,癌細(xì)胞具有透明或空泡狀的胞質(zhì);B.腸母細(xì)胞表型呈普通腸型形態(tài),缺乏可識別性的形態(tài)學(xué)特征

3 討論

本組200例分化型早期胃腺癌中有10.5%(21/200)具有腸母細(xì)胞表型，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于非腸母細(xì)胞表型者(76.2%vs12.8%)，是分化型早期胃癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立高危因素。因此，分化型早期胃癌中具有腸母細(xì)胞表型者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險更高，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者的腸母細(xì)胞表型比例較高，提示腸母細(xì)胞表型在評估此類胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時具有重要的臨床參考價值。

鑒于腸母細(xì)胞表型與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對早期分化型胃癌評估其是否具有腸母細(xì)胞表型非常必要。大部分具有腸母細(xì)胞表型的分化型早期胃癌缺乏顯著的組織學(xué)特征，本組21例中僅1例具有特征性形態(tài)，為伴腸母細(xì)胞分化的胃腺癌，其余20例與普通的腸型腺癌難以區(qū)分。因此，對腸母細(xì)胞表型的確認(rèn)主要依靠免疫組化檢測SALL4、GPC3和AFP表達(dá)。本組檢測的是外科手術(shù)切除的大標(biāo)本，部分病例僅局灶表達(dá)SALL4、GPC3或AFP，如果使用體積較小的胃鏡活檢標(biāo)本進(jìn)行檢測，即使未檢測到腸母細(xì)胞表型，在術(shù)后的大標(biāo)本中仍應(yīng)繼續(xù)檢測，以免漏診，這對于內(nèi)鏡切除治療的患者尤為重要。

目前，日本胃鏡協(xié)會的早期胃癌內(nèi)鏡治療標(biāo)準(zhǔn)可明顯降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險：符合絕對切除標(biāo)準(zhǔn)者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率幾乎為0[13-14]；符合Ex-1、Ex-2者低于1%；然而，符合擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)Ex-SM1者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率可升高至3%[15]，此類患者在進(jìn)行內(nèi)鏡治療時評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險尤為重要。本組有4例符合擴(kuò)展胃鏡切除標(biāo)準(zhǔn)的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中1例符合Ex-2；3例符合Ex-SM1，均具有腸母細(xì)胞表型的表達(dá)(占75%)；提示符合Ex-SM1且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分化型早期胃癌中，具有腸母細(xì)胞表型者可能占有較大比例。對于侵犯黏膜下層的早期胃癌，檢測其是否具有腸母細(xì)胞表型表達(dá)可作為內(nèi)鏡治療標(biāo)準(zhǔn)的有益補(bǔ)充，有助于排除淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險較高的病例。

本組中具有腸母細(xì)胞表型的分化型早期胃癌的侵犯深度更深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，說明此類胃癌在早期即具有較高的惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力。盡管其表現(xiàn)為高或中分化，但其具有高侵襲性，因此對于符合擴(kuò)展內(nèi)鏡切除標(biāo)準(zhǔn)的此類病例，有必要采取更嚴(yán)格謹(jǐn)慎的臨床措施，如更加密切的隨訪或考慮追加手術(shù)治療，或按照更為嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)評估是否適合內(nèi)鏡治療。

一項研究顯示[16]，在35例肝樣腺癌/具有腸母細(xì)胞分化胃腺癌患者中，各組織學(xué)成分的HER-2陽性率以普通腸型(48.1%)、腸母細(xì)胞分化(34.6%)和肝樣(25.0%)形態(tài)的順序遞減，但均高于對照組腸型胃癌(13.8%)。此外，HER-2陽性普通型胃癌發(fā)展成肝樣腺癌/具有腸母細(xì)胞分化胃腺癌的風(fēng)險高于HER-2陰性胃癌。本組也發(fā)現(xiàn)腸母細(xì)胞表型與HER-2表達(dá)/擴(kuò)增有關(guān)。根據(jù)癌癥基因組圖譜的分子分型，具有腸母細(xì)胞表型的胃癌通常被歸類為染色體不穩(wěn)定型[17]，并且與患者預(yù)后不良相關(guān)。大多數(shù)HER-2擴(kuò)增的胃癌也屬于此型，表明HER-2陽性和腸母細(xì)胞表型胃癌有重疊[5]。染色體不穩(wěn)定型是最大的一組亞型，約占50%，具有較大的異質(zhì)性[18]，有必要進(jìn)一步鑒別其中不同的生物學(xué)亞群，腸母細(xì)胞表型是其中具有侵襲性的一類，有必要將其應(yīng)用于病理檢查、指導(dǎo)臨床治療。

綜上所述，少數(shù)分化型早期胃腺癌具有腸母細(xì)胞表型，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是其獨立的危險因素。建議采取更嚴(yán)格的臨床措施或評估標(biāo)準(zhǔn)，避免因內(nèi)鏡治療所帶來的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床風(fēng)險。