陳福暖，高曉琳，曾曉憐，謝彩霞，汪志文,2，魯義善,2，吳灶和，王忠良,2，王 蓓,2

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088； 2.廣東海洋大學(xué) 深圳研究院，廣東 深圳 518000 )

白細(xì)胞分化抗原2(CD2)是T淋巴細(xì)胞上一類重要的黏附分子，它通過與胸腺基質(zhì)細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面CD2配體結(jié)合，在T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟及活化中發(fā)揮著重要的作用[1]。細(xì)胞表面特異性黏附分子的表達(dá)，使多細(xì)胞生物的許多細(xì)胞選擇性地附著于自身類型的細(xì)胞上[2]。這種具有選擇性的細(xì)胞黏附或細(xì)胞分選在細(xì)胞調(diào)控形態(tài)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用。在大鼠中CD48為CD2的主要結(jié)合配體，而在人類中CD2的主要結(jié)合配體則是具有高親和力的CD58。CD2與配體分子的相結(jié)合，對大多數(shù)T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞發(fā)育成熟及活化表現(xiàn)出一定的共刺激作用[3-5]。近年來CD2分子、CD2配體以及它們形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)性質(zhì)的解析研究取得了很大的進(jìn)展，進(jìn)一步豐富了哺乳動(dòng)物中CD2分子的功能研究[6-7]；但關(guān)于魚類CD2基因的相關(guān)信息卻少有報(bào)道。

目前，羅非魚是世界上養(yǎng)殖最普遍的魚類之一，也是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種，在全國淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)品產(chǎn)量中排名第6位[8]。引起羅非魚病害的根本原因是養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和養(yǎng)殖魚類抗病力的下降[9]。對此，可以通過測定酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的活性來初步判斷魚類免疫力的高低，進(jìn)而選擇最佳的養(yǎng)殖環(huán)境[10]。盡管目前已有研究表明，硬骨魚類擁有T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，CD3不同肽鏈的cDNA序列以及CD4、CD8分子的cDNA序列已相繼被證明在多種魚類中存在[11]，但魚類的免疫系統(tǒng)研究依舊處于起步階段，而對魚類CD2表達(dá)譜和功能特性的研究相對較少，甘楨等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CD2胞質(zhì)結(jié)合蛋白2(CD2BP2)基因全長1429 bp，并具有頭腎、脾臟等免疫組織高表達(dá)特征。因此，筆者旨在通過克隆鑒定尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)中與CD2具有相似結(jié)構(gòu)的CD2-like基因和探究其胞外區(qū)原核表達(dá)情況，優(yōu)化表達(dá)條件，以及在變性條件下，復(fù)性純化出相關(guān)功能蛋白，為進(jìn)一步研究CD2-like在羅非魚中的免疫功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用健康尼羅羅非魚，體質(zhì)量(150±50) g，購于高州朗業(yè)畜牲漁業(yè)科技養(yǎng)殖有限公司，且于廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院東海島海洋生物基地暫養(yǎng)4周。

1.1.2 質(zhì)粒

克隆載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司(大連)，原核表達(dá)載體pGEX-6P-1由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑

總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Ex Taq DNA聚合酶、T4連接酶、EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒購自Thermo公司，瓊脂糖、尿素、二硫蘇糖醇、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoil) DH5α以及BL21菌株由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 尼羅羅非魚總RNA的提取及cDNA的合成

尼羅羅非魚于(25±2) ℃暫養(yǎng)4周后，在無菌操作臺(tái)上取健康尼羅羅非魚頭腎組織15～20 mg，按照北京全式金TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒的說明方法提取總RNA后。將提取的上述組織按照北京全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2 CD2-like基因的克隆

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中羅非魚CD2-like基因(GenBank登錄號(hào)：XM_005460661.4)片段序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)羅非魚CD2-like基因的ORF引物On-CD2L-1F和On-CD2L-1110R9(表1)。以羅非魚頭腎組織cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min[10-13]。然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳檢測、目的條帶純化回收、與pMD 18-T Vector連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化步驟后，挑選克隆用菌落PCR鑒定，并將挑選的陽性克隆樣本送至廣州生物工程有限公司測序。

表1 試驗(yàn)所用引物Tab.1 PCR primers used in this experiment

1.2.3 CD2-like胞外區(qū)基因的克隆

與測序結(jié)果比對無誤后，根據(jù)羅非魚CD2-like基因胞外區(qū)片段(G88～A645)設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物：On-6P1-CD2L-88F和On-6P1-CD2L-645F。以pMD18T-CD2L為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min[10-13]。然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳檢測、目的條帶純化回收、與pMD 18-T Vector連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化步驟后，挑選克隆用菌落PCR鑒定，并將挑選的陽性克隆樣本送至廣州生物工程有限公司測序。

1.2.4 CD2-like基因序列的分析

將挑選的陽性克隆的測序結(jié)果用DNAMAN Version 6 軟件進(jìn)行拼接，以獲得OnCD2-like編碼序列。OnCD2-like序列比對分析：美國國立生物技術(shù)信息中心 (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)；氨基酸序列推導(dǎo)、開放閱讀框確定、理論等電點(diǎn)預(yù)測、分子量和親水性參數(shù)的分析推導(dǎo)：ORF Finder (http:∥www.ncbi.nim.nih.gov/govf/govf.html)和ExPASy Proteomics Server (http:∥ca.expasy.org)；信號(hào)肽序列預(yù)測：SignalP 4.0 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/signalp)；跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測：TMHMM Server2.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)；氨基酸基本功能位點(diǎn)分布預(yù)測：SoftBerry-Psite (http:∥linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=psite&group=programs&subgroup=proloc Inter Proscan)；蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析：Inter ProScan Sequencesearch (http:∥www.ebi.ac.uk/Tools)；二級結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析：SOPMA (https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISSM-MODEL (http:∥swissmodel.expasy.org/inter active)；鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹：Clustal X 和MEGA 6.0 軟件，利用MEGA 6.0 采用鄰位相連法構(gòu)建CD2-like系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取測序正確的重組質(zhì)粒和pGEX-6P-1表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ進(jìn)行雙酶切后，用T4連接酶和CD2-like胞外區(qū)片段的酶切產(chǎn)物連接，而后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,并于搖床上以37 ℃、200 r/min條件培養(yǎng)1 h。用含有Amp+的LB平板篩選結(jié)合菌落，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將陽性克隆重組質(zhì)粒送廣州生物工程有限公司測序。

1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白

將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pGEX-6P1-CD2L，并將含有表達(dá)載體的大腸桿菌BL21以1∶100數(shù)量比例接種于Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃的搖床200 r/min 擴(kuò)大培養(yǎng)至600 nm光密度值(D600)達(dá)0.4～0.6時(shí)加入IPTG，使其終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。菌體預(yù)處理后進(jìn)行超聲破碎獲取全菌蛋白，程序設(shè)置為：200 W條件下破碎4 s，間隔6 s，破碎時(shí)間為10 min。直至菌液變清，離心，收集上清液和沉淀后經(jīng)SDS-PAGE 分析。

1.2.7 重組蛋白表達(dá)的條件優(yōu)化

(1)IPTG濃度：在確定溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為6 h的條件下，設(shè)置IPTG濃度分別為0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L，收集菌體，用SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。采用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳。丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù)：分離膠10%，濃縮膠5%。每孔上樣10 μL，濃縮膠以80 V電壓通電30 min，分離膠以120 V電壓通電1 h，染色，脫色。

(2)時(shí)間：在確定溫度為37 ℃，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L的條件下，誘導(dǎo)2、4、6、8、10 h分別收集菌體，用SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。

(3)溫度：IPTG濃度為1.0 mmol/L，在18、28、37 ℃條件下誘導(dǎo)6 h，離心后置于冰上進(jìn)行超聲破碎，程序設(shè)置為：200 W條件下破碎4 s，間隔6 s，破碎時(shí)間為10 min，直至菌液變清，離心，收集上清液和沉淀，以SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.2.8 變性條件下重組蛋白的表達(dá)、復(fù)性以及純化

根據(jù)重組蛋白表達(dá)的條件優(yōu)化結(jié)果，利用含有Amp+的500 mL 營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基對活化后的目的菌種進(jìn)行大量原核表達(dá)，將經(jīng)原核表達(dá)的菌種分次加入50 mL離心管，離心收集菌體。

(1)目的菌體的收集：收集好細(xì)菌沉淀后，每克細(xì)菌沉淀濕質(zhì)量加入2～5 mL的破碎緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0內(nèi)含150 mmol/L氯化鈉、1 mmol/L苯甲基磺酰氟)，并加入500 mmol/L溶菌酶至終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，混勻，冰浴30 min。隨后冰上進(jìn)行超聲破碎，200 W條件下超聲6 s、間隔 8 s，至懸液半透明。

(2)包涵體收集清洗：于4000 r/min轉(zhuǎn)速下4 ℃離心50 min，棄上清液，用破碎緩沖溶液重懸沉淀并將懸液再次于4000 r/min轉(zhuǎn)速下4 ℃離心50 min，棄上清液后往沉淀中加入洗滌液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，內(nèi)含2 mol/L尿素、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.5% Triton X-100、0.1 mol/L氯化鈉以及10 mmol/L二硫蘇糖醇)，4000 r/min，4 ℃離心10 min后收集沉淀。

(3)包涵體的稀釋復(fù)性：將洗滌后的包涵體沉淀，加入變性液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，含8 mol/L尿素、20 mmol/L二硫蘇糖醇)進(jìn)行過夜變性溶解；次日，將溶解后的包涵體溶液加入復(fù)性液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，含0.5 mmol/L乙二胺四乙酸、50 mmol/L氯化鈉、5%甘油、1 mmol/L二硫蘇糖醇)并按照2倍體積倍比進(jìn)行梯度稀釋復(fù)性，直至稀釋到尿素終濃度達(dá)到 0.5 mol/L；最后利用截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾濃縮管濃縮復(fù)性后的溶液。

(4)復(fù)性后包涵體的純化：此后與以8∶1體積比例的谷胱甘肽瓊脂糖樹脂勻漿混合，4 ℃旋轉(zhuǎn)30 min，于4000 r/min離心5 min后棄上清液。沉淀加入10倍于柱床體積的漂洗液(Tris-HCl pH 8.0)反復(fù)顛倒混勻以洗去未與谷胱甘肽瓊脂糖樹脂結(jié)合的雜蛋白，于離心機(jī)4 ℃，500 r/min離心5 min后棄上清液，重復(fù)3次；加入等柱床體積的洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，內(nèi)含10 mmol/L谷胱甘肽)重懸樹脂，室溫孵育10 min 后于4000 r/min離心5 min保留上清液；再用等體積的洗脫緩沖液洗脫并離心后合并2次所得上清液，即為純化得到的谷胱甘肽(GST)融合蛋白；取40 μL該蛋白溶液與6×Loading buffer，以體積比1∶5混勻，煮沸5 min后離心收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE，觀察蛋白純化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚CD2-like基因的克隆及理化性質(zhì)

克隆獲得尼羅羅非魚CD2分子同源類似物，并命名為OnCD2-like(GenBank登錄號(hào)為：MN296489)，開放閱讀框?yàn)?110 bp，其中胞外區(qū)長558 bp，可編碼369個(gè)氨基酸(圖1)。理論分子質(zhì)量41.53 ku，理論等電點(diǎn)(PI)為9.76。使用Signal P 4.1 Server 預(yù)測該序列的信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)前29個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列；利用TMHMM Server v. 2.0在線網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，OnCD2-like蛋白的第1～215位氨基酸位于細(xì)胞外，第242～369位氨基酸位于細(xì)胞內(nèi)，而216～241位氨基酸為跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)。SoftBerry-Psite預(yù)測該序列功能位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該序列N-糖基化位點(diǎn)有3個(gè)，腺苷一磷酸和環(huán)磷鳥嘌呤核苷依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)3個(gè)，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)有9個(gè)，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)2個(gè)，N-豆蔻酰化位點(diǎn)2個(gè)，原生質(zhì)膜脂筏附著位點(diǎn)2個(gè)，CAAX box 3個(gè)，C末端定位信號(hào)序列微體4個(gè)。

圖1 OnCD2-like基因序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig.1 Sequence and deduced amino acid sequence of OnCD2-like gene“”表示信號(hào)肽； “----”表示免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(38～101)； “”表示免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(126～197)； “”表示富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(230～369).“”stands for signal peptide; “----” stands for immunoglobulin-like domain (38—101); “” stands for immunoglobulin-like domain (126—197); “” stands for proline-rich domain (230—369).

圖2 OnCD2-like跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.2 Predicted transmembrane domain of CD2-like protein in tilapia

ProtParam在線分析結(jié)果顯示，推測賴氨酸(Lys)占比為8.7%；谷氨酰胺(Gln)為8.1%；蛋氨酸(Met)為0.8%。其中帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)有55個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)有31個(gè)。不穩(wěn)定指數(shù)為44.60，歸類為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白脂溶指數(shù)為66.83，總平均親水值為-0.799，很有可能是親水蛋白。ProtScale分析表明，OnCD2-like蛋白親水性氨基酸占比較高，親水區(qū)域較大，為親水性蛋白，與理化分析的結(jié)果一致。因此推測On-CD2-like基因編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白。

2.2 OnCD2-like二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA分析OnCD2-like的二級結(jié)構(gòu)(圖3)，發(fā)現(xiàn)該蛋白二級結(jié)構(gòu)中存在：由56個(gè)氨基酸組成的α螺旋，占15.18%；由15個(gè)氨基酸組成的β轉(zhuǎn)角，占4.07%；由85個(gè)氨基酸組成的延伸鏈，占23.01%；由213個(gè)氨基酸組成的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，占57.72%。利用SWISS-MODLE在線預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)工具分析發(fā)現(xiàn)，OnCD2-like屬于免疫折疊蛋白，能夠與人類CD2分子高度重合，表明OnCD2-like與人類CD2分子結(jié)構(gòu)具有一定相似性(圖4)。

圖3 OnCD2-like二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 The prediction of secondary structure of OnCD2-like

圖4 OnCD2-like蛋白與人類CD2蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.4 The three-dimensional structures of CD2-like protein in tilapia and CD2 in Homo sapiens

2.3 OnCD2-like系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究基于OnCD2-like氨基酸序列以及斑馬擬麗魚(Maylandiazebra)、多刺棘光鰓鯛(Acanthochromispolyacanthus)、眼斑雙鋸魚(Amphiprionocellaris)、高山倭蛙(Nanoranaparkeri)、原雞(Gallusgallus)、家鼠(Musmusculus)、家牛(Bostaurus)和人(Homosapiens)等的相關(guān)數(shù)據(jù)，在MEGA 6.0軟件中采用鄰接方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。分析該進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚和同屬鱸形目慈鯛科的斑馬魚親緣關(guān)系最為相近，且聚為一支；其次與同屬鱸形目的泰國斗魚(Bettasplendens)親緣關(guān)系也較相近，與其他哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系則相對較遠(yuǎn)(圖5)。

圖5 OnCD2-like氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of CD2-like amino acid sequence of tilapia

2.4 OnCD2-like胞外區(qū)原核表達(dá)

根據(jù)OnCD2-like基因設(shè)計(jì)引物，克隆獲取該基因胞外段(G88～A645)，并成功構(gòu)建pGEX-6P1-CD2L原核表達(dá)載體。原核表達(dá)結(jié)果顯示，未誘導(dǎo)的菌株前后均未出現(xiàn)目的蛋白，重組蛋白主要在包涵體中表達(dá)(圖6a)，pGEX-6P1-CD2L融合蛋白分子質(zhì)量約為46 ku，OnCD2-like胞外區(qū)片段蛋白分子質(zhì)量約為20 ku。隨后原核表達(dá)條件摸索試驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度為0.2 mmol/L的IPTG即可誘導(dǎo)目的蛋白高效表達(dá)(圖6b)；2～10 h目的蛋白的表達(dá)量增加，6 h后表達(dá)量增加不明顯(圖6c)；重組蛋白GST-CD2-like融合蛋白在18、28、37 ℃的包涵體蛋白中均有表達(dá)，在37 ℃條件下蛋白表達(dá)量較高(圖6d)。

圖6 GST-CD2-like融合蛋白表達(dá)及其條件優(yōu)化SDS-PAGE分析Fig.6 Expression protein and SDS-PAGE analysis of optimized conditions in GST-CD2-like fusiona：M.全式金蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)； 1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白； 2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白； 3、4.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的上清液、沉淀重組蛋白表達(dá). b：M.全式金蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)； 1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白； 2～6. IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L 誘導(dǎo)后的全菌蛋白. c：M.賽默飛世爾蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)； 1.未誘導(dǎo)的全菌蛋白； 2～6.全菌蛋白誘導(dǎo)時(shí)間分別為2、4、6、8、10 h. d：M.全式金蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)； 1～2.對照組未誘導(dǎo)及18 ℃誘導(dǎo)； 3～4.對照組未誘導(dǎo)及28 ℃誘導(dǎo)； 5～6.對照組未誘導(dǎo)及全菌蛋白.a: M.Trans protein molecular marker; 1.whole bacterial protein without IPTG inducing; 2.whole bacterial proteinr with IPTG inducing; 3,4.supernatant and precipitated recombinant protein expression with IPTG inducing. b: M.Trans protein molecular marker; 1.whole bacterial protein without IPTG inducing; 2—6.total protein of recombinant bacteria induced by 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, and 1.6 mmol/L IPTG. c: M.Thermo Fisher protein molecular marker; 1.the recombinant bacteria without IPTG inducing; 2—6.total protein of recombinant bacteria inducing at 2, 4, 6, 8 and 10 h, respectively. d: M.Trans protein molecular marker; 1—2.the recombinant bacteria without IPTG inducing and inclusion body protein induced at 18 ℃; 3—4.the recombinant bacteria without IPTG inducing and inclusion body protein induced at 28 ℃; 5—6.the recombinant bacteria without IPTG inducing and inclusion body protein.

2.5 包涵體中GST-CD2-like融合蛋白的變性、復(fù)性與純化

在包涵體蛋白復(fù)性純化過程中分別選取經(jīng)洗滌液洗滌后、復(fù)性后和純化洗脫后3個(gè)不同階段的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖7)。結(jié)果顯示，CD2-like融合蛋白表達(dá)含量高(圖7泳道1)；當(dāng)?shù)鞍兹芤罕粡?fù)性液等濃度梯度稀釋至尿素終濃度為0.5 mol/L(即相當(dāng)于稀釋16倍)時(shí)，GST-CD2-like融合蛋白仍然保持可溶，盡管復(fù)性后蛋白存在部分降解，但依舊有相當(dāng)一部分結(jié)構(gòu)完整的GST-CD2-like融合蛋白保留(圖7泳道2)；將復(fù)性濃縮后的融合蛋白利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂進(jìn)行親和層析純化，潤洗去除雜蛋白后最終用10 mmol/L還原型谷胱甘肽溶液進(jìn)行目標(biāo)蛋白的洗脫，得到目的融合蛋白(圖7泳道3)，并且將洗脫液洗脫后的融合蛋白與標(biāo)簽蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖8)。綜上所述，本研究成功地在變性條件下，通過純化復(fù)性獲取了目的蛋白。

圖7 GST-CD2-like融合蛋白變性、復(fù)性與純化等產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE of denaturation, renaturation and purification of GST-CD2-like recombinant protein M.蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)； 1. 2 mol/L 尿素溶解后包涵體全菌蛋白； 2.梯度稀釋復(fù)性后經(jīng)10 ku濃縮管濃縮后的全菌蛋白； 3.谷胱甘肽瓊脂糖樹脂純化后的GST-CD2-like融合蛋白.M.protein molecular marker; 1.inclusion body whole bacterial protein after 2 mol/L urea dissolution; 2.whole-bacterial protein after concentration and renaturation in a 10 ku concentrating tube; 3.GST-CD2-like-I fusion protein by glutathione agarose resin purification.

圖8 重組蛋白pGEX-6P1-CD2L SDS-PAGE分析Fig.8 Identification of GST-CD2-like recombinant proteins by SDS-PAGEM.蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)； 1.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的GST標(biāo)簽蛋白； 2.純化后的包涵體蛋白SDS-PAGE結(jié)果.M.protein molecular marker; 1.GST-tagged protein with IPTG inducing; 2.SDS-PAGE results of purified inclusion body protein.

3 討 論

T淋巴細(xì)胞激活需要兩組信號(hào)：一是通過T淋巴細(xì)胞上的T淋巴細(xì)胞抗原受體(TCRs)與抗原肽—主要組織相容性復(fù)合體(p-MHC)結(jié)合提供刺激信號(hào)；二是通過T淋巴細(xì)胞上的共刺激受體與抗原提呈細(xì)胞上的配體的相互作用提供信號(hào)。CD2是能夠傳遞共刺激信號(hào)最具特征的受體之一，主要是在T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞表面表達(dá)的一種細(xì)胞表面糖蛋白，在刺激T淋巴細(xì)胞的活化與細(xì)胞黏附方面起著重要作用[14-15]。近年來，相關(guān)研究表明，多種哺乳動(dòng)物中存在CD2，其結(jié)構(gòu)以免疫功能等的相關(guān)研究較多[16-18]；在哺乳動(dòng)物中，CD2可以作為共刺激分子發(fā)揮作用，促進(jìn)白細(xì)胞介素2(IL-2)的產(chǎn)生，IL-2是促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖分化的最重要的細(xì)胞因子；同時(shí)在自然殺傷細(xì)胞上的CD2也是介導(dǎo)效應(yīng)靶結(jié)合形成的重要因子，并通過z鏈傳遞下游信號(hào)，引起細(xì)胞毒性顆粒的胞吐作用[19-21]。但迄今為止對于魚類CD2的研究較少，目前在硬骨魚類中CD2基因克隆鑒定研究僅見銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[22]、斑點(diǎn)叉尾(Ietaluruspunetaus)[23]以及尼羅羅非魚[24]等少數(shù)硬骨魚，對魚類CD2表達(dá)譜及功能特性的研究也相對有限。已有研究表明，CD2可能在尼羅羅非魚細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[24]。

3.1 OnCD2-like基因序列結(jié)構(gòu)分析

依據(jù)預(yù)測序列，對尼羅羅非魚CD2分子同源類似物進(jìn)行克隆鑒定，獲得OnCD2-like基因全長為1110 bp，可以編碼369個(gè)氨基酸。預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白序列含有1個(gè)信號(hào)肽區(qū)域和2個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。此外，通過SoftBerry-Psite在線預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該分子胞外區(qū)還具有2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(氨基酸位點(diǎn):129～131，168～170)，這暗示著位于該蛋白胞外區(qū)具有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)，對于抗原信息傳遞具有重要作用。通過InterPro 在線軟件分析OnCD2-like氨基酸序列中的保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)尾區(qū)富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(230～369)，已有研究證明，該結(jié)構(gòu)域在鼠與人之間有著顯著的同源性，表現(xiàn)出較高的保守性[25]。綜上所述，基于相關(guān)的保守結(jié)構(gòu)域和位點(diǎn)較為保守推測，OnCD2-like蛋白功能保守。

3.2 OnCD2-like胞外區(qū)蛋白

原核表達(dá)結(jié)果顯示，重組蛋白大部分以包涵體形式存在，并且在37 ℃下，0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h時(shí)，包涵體蛋白表達(dá)量最高。在原核表達(dá)過程中，為求目的蛋白以高翻譯率表達(dá)而進(jìn)行高溫、高誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，但導(dǎo)致細(xì)菌蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)耗竭，引起部分折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白分子聚集而形成包涵體[26]。包涵體蛋白是非正確折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學(xué)活性[27]。鑒于OnCD2-like胞外區(qū)蛋白多以包涵體形式存在，如果能成功對表達(dá)出的目標(biāo)蛋白進(jìn)行變性溶解和復(fù)性純化，將有利于蛋白的純化以及純度的提高，從而為后續(xù)的蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。因此，筆者決定在變性條件下對OnCD2-like胞外區(qū)包涵體蛋白進(jìn)行純化復(fù)性。

3.3 OnCD2-like胞外區(qū)蛋白梯度稀釋復(fù)性

本研究中采用的包涵體復(fù)性方法為梯度稀釋復(fù)性，梯度稀釋的方法可以為蛋白提供充分的復(fù)性時(shí)間，促使蛋白質(zhì)緩慢發(fā)生變化以適應(yīng)外環(huán)境，這有利于蛋白與復(fù)性液充分結(jié)合，從而獲取大量復(fù)性后的目的蛋白。透析復(fù)性也是包涵體復(fù)性常用的方法，然而相較于梯度稀釋復(fù)性，透析復(fù)性可能會(huì)因緩沖液交換過程中尿素去除過快，導(dǎo)致蛋白大量析出而出現(xiàn)大量絮狀沉淀，不利于后續(xù)的蛋白功能研究[28]。故此，通過比較上述兩種方法，本研究中采用了梯度稀釋復(fù)性方法進(jìn)行。GST-CD2-like融合蛋白經(jīng)梯度稀釋復(fù)性后，得到目的蛋白條帶單一，無雜蛋白條帶存在，表明梯度復(fù)性純化方法純化了目標(biāo)蛋白且高效可行。本研究在變性條件下探究了該OnCD2-like分子胞外區(qū)包涵體蛋白的純化方法，這不僅為包涵體蛋白的純化復(fù)性方法提供了參考，也為進(jìn)一步研究尼羅羅非魚CD2分子在先天免疫中的功能作用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆OnCD2-like基因，全長1110 bp，其中胞外區(qū)長558 bp，可編碼369個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，OnCD2-like基因序列結(jié)構(gòu)中含有信號(hào)肽區(qū)域1個(gè)、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域2個(gè)、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)以及富含輔氨酸胞質(zhì)尾區(qū)各1個(gè)；通過免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域及富含輔氨酸的胞質(zhì)尾區(qū)所具有的結(jié)構(gòu)證明，該分子具有較高的保守性。OnCD2-like系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，尼羅羅非魚與斑馬擬麗魚聚為一支；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，OnCD2-like基因所編譯的蛋白與人類CD2蛋白具有相似性。原核表達(dá)條件優(yōu)化為：37 ℃條件下，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，依據(jù)最佳條件通過梯度稀釋復(fù)性的方法成功純化出OnCD2-like胞外區(qū)蛋白。