陳寧 隋云鵬 孟凡剛

帕金森病是一種以運動癥狀為主的神經(jīng)變性病，近年越來越多的證據(jù)表明，其為一種累及全身之病變，故更多學者開始關(guān)注帕金森病的非運動癥狀［1］。嗅覺減退是其典型的非運動癥狀，約90%以上患者存在嗅覺喪失，且在運動癥狀前數(shù)年即已存在［2］。Haehner等［2］對30例特發(fā)性嗅覺喪失患者行經(jīng)顱多普勒超聲（TCD），發(fā)現(xiàn)11例黑質(zhì)回聲增強，提示嗅覺減退與帕金森病病理改變具有相關(guān)性。然而引起該癥狀的潛在病理生理學機制尚不明確。目前普遍認為，帕金森病的病理變化主要為出現(xiàn)一種被稱為路易小體（LB）的神經(jīng)元內(nèi)α-突觸核蛋白（α-Syn）包涵體［3］，α-Syn是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前及核周表達的可溶性蛋白質(zhì)，在生理狀態(tài)下處于一種天然的未折疊狀態(tài)［4-5］。SNCA基因Ala53Thr系首個鑒別出的家族性帕金森?。‵PD）相關(guān)基因變異［6］，可引起神經(jīng)元軸突功能障礙以及相關(guān)多巴胺能神經(jīng)元凋亡［7-8］，由此可見，α-Syn與帕金森病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，鑒于帕金森病初期常伴有嗅覺減退癥狀，因此推測，SNCAAla53Thr堿基替換可能對帕金森病患者嗅球（OB）組織的代謝產(chǎn)生影響。代謝組學系從總體出發(fā)分析一個生物系統(tǒng)中某一類型的所有相對分子質(zhì)量＜1000的小分子物質(zhì)，并通過內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，從活性、功能、表達等多層面反向推理機體內(nèi)發(fā)生變化的特定代謝產(chǎn)物的一項技術(shù)［9-11］。因此，代謝組學可一次同時系統(tǒng)地挖掘變化的分子或其相關(guān)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究擬通過代謝組學技術(shù)，對SNCAAla53Thr堿基替換帕金森病小鼠模型的嗅球組織代謝產(chǎn)物變化進行分析。同時，借助代謝組學的相關(guān)研究工具，比較野生型與突變型小鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物變化，尋找與這些產(chǎn)物相關(guān)的調(diào)控通路和生物分子網(wǎng)絡(luò)，并進一步明確α-Syn的生理功能和病理意義，為帕金森病的診治提供新的參考依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物及分組 Prnp-SNCAAla53Thr純合轉(zhuǎn)基因（TG）帕金森病模型雄性小鼠共10只（A組），10月齡，體重（20±2）g，同時以相應月齡的同窩雄性野生型（WT）小鼠10只為對照（B組），體重（20±2）g，均購自南京大學模式動物研究所（許可證號：N000160），由首都醫(yī)科大學實驗動物中心按照無特定病原體（SPF）級別飼養(yǎng)。于室溫21～25℃、相對濕度40%～60%、12 h晝-12 h夜循環(huán)照明環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，均適應性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

2.主要試劑與儀器 （1）主要藥品與試劑：甲醇（規(guī)格500 ml；≥99.9%；批號152469）、乙腈（規(guī)格500 ml；≥99.9%；批號136376）、甲酸（規(guī)格500 ml；≥99.9%；批號152469）均為色譜級，以及甲酸銨（規(guī)格50 g；≥99%；批號FCMA115-50）均購自美國Thermo Fisher Scientific公 司 。（2）主 要 設(shè) 備 與 儀 器 ：DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Thermo Q EXACTIVE質(zhì)譜儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，C18色譜柱為美國Thermo Syncronis公司產(chǎn)品（管徑1.70μm，長 度2.10 mm×100.00 mm），Milli-Q AdvantageA10型超純水儀為美國Millipore公司產(chǎn)品，KQ-250超聲波清洗器為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品，5402型離心機購自德國Eppendorf公司。

二、研究方法

1.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測嗅球組織小分子代謝產(chǎn)物 （1）嗅球組織樣本的獲取：為確保轉(zhuǎn)基因小鼠處于帕金森病初期，出現(xiàn)運動癥狀前即采取頸椎脫臼法處死小鼠，取嗅球組織，生理鹽水清洗，濾紙擦干后稱重，置-80℃冰箱保存。（2）嗅球組織樣本的檢測前處理：采用甲醇∶乙腈（1∶1）有機溶劑沉淀蛋白法，在嗅球組織樣本中加入10倍甲醇，勻漿3 min，吸取勻漿液100μl，再加入甲醇∶乙腈（1∶1）有機溶劑沉淀蛋白，渦旋30 s，于4℃、離心半徑8 mm、轉(zhuǎn)速13 000 r/min離心15 min，取上清液200μl直接進樣分析，每5針平行進1針進行質(zhì)量控制，以確保重復性和儀器、樣品的穩(wěn)定性。（3）小分子代謝產(chǎn)物檢測：超高效液相色譜（UPLC）條件為，A為含0.10%甲酸和2 mmol/L甲酸銨的水、D為乙腈，梯度洗脫，分析時間為0～35 min，進樣量10μl，流速0.30 ml/min；流動相梯度條件為，0～1 min：95%A+5%D，1～16 min：5%A+95%D，16～18 min：95%A+5%D。串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）條件為，電噴霧電離（ESI）陰性；監(jiān)測模式為一級全掃描（full scan），二級數(shù)據(jù)依賴性掃描（full MS/dd-MS2）；離子源參數(shù)ESI陰性；噴霧電壓2800 V，蒸發(fā)溫度350℃；化合物參數(shù)一級全掃描分辨率為70 000，二級數(shù)據(jù)依賴性掃描分辨率為35 000。

2.數(shù)據(jù)處理 收集所有樣本的數(shù)據(jù)，采用mzCloud數(shù)據(jù)庫（www.mzcloud.org）對兩組小鼠嗅球組織內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進行鑒定；采用分子式和相對分子質(zhì)量確定內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，同時通過Trace Finder軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）自建內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，并經(jīng)METLIN數(shù)據(jù)庫（https：//metlin.scripps.edu/）、人 體代謝 組數(shù)據(jù)庫（HMDB，https：//hmdb.ca/）、京都基因和基因組百科數(shù)據(jù)庫（KEGG，http：//www.kegg.jp/）檢索和確認。經(jīng)上述步驟，確定兩組小鼠嗅球組織的代謝產(chǎn)物共400余種。為尋找兩組的差異代謝產(chǎn)物，采用主成分分析在兩組樣本組內(nèi)發(fā)現(xiàn)一定的集聚成群趨勢且兩組之間樣本點彼此分離，結(jié)果提示二者內(nèi)源性代謝產(chǎn)物具有明顯差異（圖1a，1b）。再采用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）對兩組內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進行判別分析，發(fā)現(xiàn)兩組之間的樣本點彼此分離，且組內(nèi)樣本點在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的聚集趨勢，提示二者內(nèi)源性代謝產(chǎn)物有明顯差異并各自表現(xiàn)出一定的特征（圖1c～1f）。最后采用聚類分析證實二者內(nèi)源性代謝產(chǎn)物存在較明顯的差異（圖1g）。依照上述方法獲得20樣本×481變量的數(shù)據(jù)矩陣。在PLS-DA模型中提取VIP值最大的前66個變量（VIP值＞1.0）。對這66個變量進行手動積分及Mann-WhitneyU檢驗，通過對目標變量進行手動積分，并綜合VIP值、非參數(shù)檢驗和受試者工作特征曲線（ROC曲線）的精密度（＞0.50）篩選差異代謝產(chǎn)物。

3.統(tǒng)計分析方法 代謝組學相關(guān)分析和分層聚類分析并驗證經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法獲得的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)，呈正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，行兩獨立樣本的t檢驗；呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。采用R語言數(shù)據(jù)分析軟件（R version 3.2.4，https：//www.R-project.org/）進行高通量代謝通路分析，代謝通路影響值的臨界值設(shè)置為0.10。采用MetPA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建內(nèi)源性代謝產(chǎn)物之代謝通路，采用Cytoscape、Metsape和MCODE插件繪制內(nèi)源性代謝產(chǎn)物網(wǎng)絡(luò)圖并進行模塊化分析。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

經(jīng)數(shù)據(jù)篩選和驗證最終確定29個變量為代謝產(chǎn)物的潛在生物學標志物。對兩組小鼠嗅球組織代謝產(chǎn)物中潛在生物學標志物的相對表達量進行比較，結(jié)果顯示，溶血性磷脂酰膽堿（16：0）、溶血性磷脂酰乙醇胺［0：0/18：1（9Z）］、溶血性磷脂酰膽堿［18：1（11Z）］、溶血性磷脂酰乙醇胺［20：4（8Z，11Z，14Z，17Z）/0：0］、溶血性磷脂酰膽堿［18：3（6Z，9Z，12Z）］、維生素C、磷脂酰膽堿［18：1（9Z）/20：4（5Z，8Z，11Z，14Z）］、鞘磷脂（d18：1/18：0）、磷脂酰膽堿［14：1（9Z）/20：0］、磷脂酰膽堿［16：1（9Z）/20：3（8Z，11Z，14Z）］、磷脂酰甘油［18：0/16：1（9Z）］、磷脂酰膽堿［20：1（11Z）/14：1（9Z）］、磷脂酰甘油（18：0/16：0）、谷氨酸和磷脂酰膽堿［18：0/20：4（8Z，11Z，14Z，17Z）］含量在TG組中有所上升（均P＜0.05），提示上述15種生物學標志物均為上調(diào)的差異代謝產(chǎn)物，且其相對表達量與下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物呈負相關(guān)（圖2）。而單?；视王ィ?0：4（5Z，8Z，11Z，14Z）/0：0/0：0］、溶血性磷脂酰乙醇胺［0：0/16：1（9Z）］、鞘磷脂（d18：1/16：0）、磷脂酰膽堿［20：3（5Z，8Z，11Z）/14：1（9Z）］、β-丙氨?；?L-組氨酸、神經(jīng)酰胺［d18：1/18：1（11Z）］、磷脂酰膽堿［16：1（9Z）/22：2（13Z，16Z）］、溶血性磷脂酰乙醇胺［20：3（5Z，8Z，11Z）/0：0］、溶血性磷脂酰膽堿［18：2（9Z，12Z）］、磷脂酰甘油［16：0/18：1（9Z）］、磷脂酰膽堿［16：1（9Z）/22：5（7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）］、?；撬?、纈氨酸和 γ-氨基丁酸（GABA）含量在TG組中有所下降（均P＜0.05），提示上述14種生物學標志物均為下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物，且其相對表達量與其他下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物呈正相關(guān)（圖2）。綜合表1中的代謝產(chǎn)物可見，轉(zhuǎn)基因小鼠嗅球組織中差異性表達的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物以磷脂為主，包括GABA等神經(jīng)遞質(zhì)以及幾種氨基酸。分層聚類分析熱圖顯示，兩組小鼠內(nèi)源性差異代謝產(chǎn)物中多種磷脂、氨基酸和脂肪酸之間差異顯著，提示二者的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物組分差異明顯（圖3）。

表1 TG組與WT組小鼠嗅球組織代謝產(chǎn)物潛在生物學標志物相對表達量的比較Table 1.Relative content of potential biomarkers in OB samples of TG group and WT group

圖2 嗅球組織內(nèi)源性代謝產(chǎn)物相關(guān)分析熱圖（紅色代表正相關(guān)，藍色代表負相關(guān)，顏色越深代表相關(guān)性越強）Figure 2 The heat map of correlation analysis of important endogenous metabolites(the positive correlation represented in red and the negative correlation represented in blue, the deeper indicated stronger correlation and the lighter indicated the weaker correlation).

采用R語言數(shù)據(jù)分析軟件對兩組小鼠嗅球組織中差異代謝產(chǎn)物的代謝通路分析，結(jié)果顯示，?；撬岷蛠喤；撬幔劝滨０泛凸劝彼?，維生素C，甘油磷脂，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路影響值均 ≥0.10（表2），同時結(jié)合代謝通路圖（圖4）。提示本研究篩選出的29種差異代謝產(chǎn)物與上述代謝通路密切相關(guān)，其中以磷脂和氨基酸代謝通路受到的影響較大，亦與GABA等神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，提示轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的代謝差異與這些代謝通路密切相關(guān)，且受影響較為廣泛，基于神經(jīng)遞質(zhì)和磷脂等對正常神經(jīng)功能的重要性，提示小鼠神經(jīng)功能可能受損。

表2 構(gòu)建分析通路結(jié)果（影響值≥0.10）Table 2.Constructed analytical pathway(Impact≥0.10)

圖4 經(jīng)MetPA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物代謝通路圖4a 內(nèi)源性代謝產(chǎn)物代謝通路影響值 4b 內(nèi)源性代謝產(chǎn)物對代謝通路影響的貢獻率圖Figure 4 Endogenous metabolites-related pathways constructed by MetPA database Influence value of themetabolic pathways formed by endogenous metabolites(Panel 4a).Contribution percentage of the metabolomic pathways formed by endogenous metabolites(Panel 4b).

經(jīng)Cytosape、Metsape和MCODE插件富集相關(guān)代謝通路并進一步構(gòu)建內(nèi)源性代謝產(chǎn)物與其藥效相關(guān)的復合網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)TG組與WT組的29種潛在生物學標志物中相應代謝產(chǎn)物相對表達量存在較明顯的差異。根據(jù)兩組之間差異內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的相關(guān)性，繪制代謝組學網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物如磷脂、脂肪酸和氨基酸等之間的內(nèi)在關(guān)系及內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化均相互聯(lián)系（圖5）。

圖5 TG組與WT組小鼠嗅球組織差異性代謝產(chǎn)物之間的代謝組學網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Metabolomic network of the differential metabolites in OB tissues of TG group and WT group.

討 論

α-Syn是一種表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前及核周，并且在生理狀態(tài)下呈未折疊狀態(tài)的可溶性蛋白質(zhì)［12］，其突變與帕金森病尤其是家族性帕金森病的發(fā)生密切相關(guān)［13-14］。此外，SNCAAla53Thr堿基替換可導致其異常聚集或產(chǎn)生寡聚體，產(chǎn)生神經(jīng)毒性并引起多巴胺能神經(jīng)元凋亡［15-19］，從而引發(fā)帕金森病。

代謝組學是近年發(fā)展起來的對機體中內(nèi)源性小分子物質(zhì)的整體及其動態(tài)變化規(guī)律進行檢測分析的一門新技術(shù)。其研究對象是特定生物體系受到干預后產(chǎn)生的內(nèi)源性代謝變化，并對能描述代謝循環(huán)情況的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析，從而明確該生物復雜系統(tǒng)中所有組分的構(gòu)成及在特定條件下這些組分之間的相互關(guān)系［9，20］。目前最常用的分離分析手段包括氣相色譜法、LC-MS/MS法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法及MRI技術(shù)。

本研究通過LC-MS/MS法以及代謝組學信息學分析手段，對SNCAAla53Thr堿基替換轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠嗅球組織中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進行檢測，并采用PCA、聚類分析等化學計量學方法對所獲得的數(shù)據(jù)進行深入挖掘。結(jié)果顯示，SNCAAla53Thr堿基替換使牛磺酸和亞?；撬岽x通路，谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路，維生素C代謝通路，甘油磷脂代謝通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路受到較明顯的影響，其中受影響較大的是磷脂及氨基酸代謝途徑，GABA等神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)代謝通路亦受到影響。受影響的代謝通路涉及多種差異內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，包括多種磷脂和氨基酸，以及以GABA為代表的神經(jīng)遞質(zhì)。

有趣的是，予小鼠單側(cè)嗅球α-Syn纖維可以有效形成帕金森病的前驅(qū)模型，提示嗅球病理改變在帕金森病的發(fā)生與發(fā)展中十分關(guān)鍵［21］。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠嗅球組織中各類磷脂如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰甘油等均有較為明顯的變化且以表達上調(diào)為主。該變化可能與α-Syn有關(guān)，調(diào)節(jié)磷脂代謝即為α-Syn的重要功能之一，其可抑制磷脂酶D2（PLD2）［22］將磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)變?yōu)榱字岬淖饔茫?3］。而SNCAAla53Thr堿基替換恰好可增強該功能［24］。此外，在SNCAAla53Thr堿基替換小鼠嗅球組織中可見GABA明顯降低等神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常，且本研究在出現(xiàn)運動癥狀之前即已處死小鼠并取其嗅球組織，說明SNCAAla53Thr堿基替換小鼠在出現(xiàn)運動癥狀之前即可出現(xiàn)較明顯的神經(jīng)功能異常。這與臨床罹患帕金森病患者在運動癥狀出現(xiàn)之前的疾病早期階段即可出現(xiàn)嗅覺減退相吻合［2，25-26］。這一現(xiàn)象可能與上述嗅球組織的磷脂代謝異常有關(guān)，磷脂構(gòu)成髓鞘，對神經(jīng)傳導等有重要意義，故各類磷脂的異常改變可以導致嗅球神經(jīng)元功能局部和整體紊亂，從而引起嗅球功能減退和代謝層面病理改變。類似改變?nèi)缌字桶被岬母淖兺瑯映霈F(xiàn)在帕金森病患者的腦脊液和血液樣本中［27-28］，說明后續(xù)帕金森病腦內(nèi)進展與初期的嗅球病理改變有相似之處，再結(jié)合通過嗅球注射α-Syn纖維可成功制備帕金森病小鼠模型［21］，提示帕金森病由嗅球起源之可能。此外，血液改變與腦脊液改變類似也符合帕金森病作為全身系統(tǒng)性疾病的特征。故對于嗅球病理改變的研究對于揭示帕金森病的起源、腦內(nèi)進展及全身改變提供啟示。

本研究首次明確小鼠SNCA基因Ala53Thr堿基替換對帕金森病早期嗅球組織代謝的影響，對進一步明確帕金森病的病理生理學機制具有一定意義。

利益沖突無