李涵，李俊，劉春生

華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，武漢 430070

水質(zhì)基準(WQC)是制定水質(zhì)標準的重要科學依據(jù)，在環(huán)境保護方面發(fā)揮著重要作用，是環(huán)保部門制定水質(zhì)標準、評價水質(zhì)和進行水質(zhì)管理不可或缺的科學依據(jù)和理論基礎[1]。美國是最早開展水質(zhì)基準研究的國家[2]，隨后許多學者針對水質(zhì)基準建立中存在的問題，提出了一系列相關的理論和方法[3-4]，目前已形成以保護水生生物和人體健康的水質(zhì)基準為主，輔以沉積物基準、營養(yǎng)物基準、細菌基準、野生生物基準、生物學基準和物理基準等較為完整的水環(huán)境基準體系[5]。在美國環(huán)境保護局水質(zhì)基準中，水生生物基準是最早制定的，它的目標在于防止化學污染物對具有商業(yè)和娛樂價值的水生生物及其他重要物種(如河流湖泊中的魚類、底棲無脊椎動物和浮游生物)造成不可接受的長期和短期影響。水生生物基準制定包含2個參數(shù)的確定，即基準最大濃度(criteria maximum concentration, CMC)和基準連續(xù)濃度(criteria continuous concentration, CCC)，這2個閾值濃度是為了防止化學污染物短期和長期作用對水生生物造成急性和慢性毒性效應而設，其值分別為水生生物短期或長期暴露在有毒物質(zhì)中，沒有產(chǎn)生不可接受的影響時，有毒物質(zhì)在環(huán)境水體中的最大濃度。CMC的制定參考的是水生動物急性毒性數(shù)據(jù)，CCC的制定參考的是水生動物慢性毒性、植物毒性、生物富集的綜合影響。在CCC制定中浮游甲殼類動物的毒理學數(shù)據(jù)是必須參考的，因為這類生物在水體中分布廣泛，具有很強的代表性。在浮游甲殼類生物中，大型溞(Daphniamagna)是最為常用的毒理學測試模式生物[6-11]，通常棲息在淡水水域環(huán)境中，在南半球及南非地區(qū)的分布非常廣泛。美國環(huán)境保護局在1978年將大型溞定為毒性試驗的必測項目，其慢性毒理學數(shù)據(jù)在美國環(huán)境保護局水質(zhì)基準CCC的制定中發(fā)揮了很重要的作用。

傳統(tǒng)的慢性毒性測試獲得的毒理學數(shù)據(jù)在大部分情況下是可以保護水生生物免受污染物危害的，然而對于一些具有較強生物累積性和環(huán)境持久性的化學污染物而言，其對大型溞的慢性毒性數(shù)據(jù)與實際風險數(shù)據(jù)可能存在一定的偏差。大型溞的壽命通常為50～100 d，在自然水體中其全生命周期可能均暴露于污染物中。傳統(tǒng)慢性暴露實驗只涵蓋其部分生命階段，可能存在以下2個不足：(1)由于慢性暴露實驗的暴露周期較短，獲得的化學污染物對生物發(fā)育生殖指標的最低觀察效應濃度(lowest observed effective concentration, LOEC)大都高于環(huán)境濃度，因此環(huán)境濃度化學污染物潛在的環(huán)境風險通常難以得到充分評估；(2)由于慢性暴露實驗是在生物的部分生命周期內(nèi)進行的，對于一些壽命較短而全生命周期都暴露于化學污染物中的生物而言，慢性暴露實驗可能會低估化學品的實際環(huán)境風險。以往的研究發(fā)現(xiàn)，當磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)對大型溞的暴露時間達到62 d時，大型溞生長和生殖指標的LOEC在32 d的基礎上均降低了一個數(shù)量級[12]。因此在對一些持久性污染物CCC的制定中，參考大型溞部分生命周期暴露的毒理學數(shù)據(jù)得出的閾值濃度在實際中可能仍然會對水生生物造成一定的毒性效應。為了探究這個問題，本研究從美國環(huán)境保護局水質(zhì)基準文件NationalRecommendedWaterQualityCriteria: 2002中選取4,4’-滴滴涕(4,4’-DDT)為代表性污染物，以其CCC為參考測試濃度，對大型溞開展全生命周期暴露實驗，評估閾值濃度的4,4’-DDT對大型溞不同生命階段生長、生殖、心率、行為、存活和基因轉(zhuǎn)錄等指標的影響并比較各指標LOEC與暴露時間的關系。

4,4’-DDT是一種廣泛使用的有機氯類殺蟲劑，也是一種典型的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)[13]。4,4’-DDT自身毒性不是很強，但具有很強的穩(wěn)定性，生物降解緩慢，能長期存在于環(huán)境中，并在食物鏈和生物體組織中積累，尤其是脂肪組織[14]。由于4,4’-DDT使用廣泛，目前已出現(xiàn)全球范圍的污染[15]，在許多鳥類和魚類組織中均發(fā)現(xiàn)了4,4’-DDT殘留物，包括生活在沙漠地區(qū)的鳥類或海洋深處的魚類。美國環(huán)境保護局在2002年的文件中規(guī)定4,4’-DDT在水體中的CCC為1 ng·L-1。本研究選取持久性污染物4,4’-DDT對大型溞開展全生命周期暴露實驗，旨在驗證其CCC在全生命周期暴露下是否會對水生生物造成毒性效應，從而對部分生命周期暴露和全生命周期暴露之間的關系和應用做進一步思考，以及探究在對持久性污染物進行風險評估和基準制定時應通過何種暴露手段獲取更為精準的毒理學數(shù)據(jù)來源。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗試劑

4,4’-DDT購自Dr. Ehrenstorfer試劑公司(德國)，CAS號為50-29-3，純度為98%；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自Sigma公司(美國)，CAS號為67-68-5，純度>99%；總RNA提取所需的RNAiso Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT reagent kit及熒光定量試劑SYBR? Primex Ex TaqTMⅡ均購自TaKaRa公司(大連，中國)；氯仿(CAS 67-66-3)、異丙醇(CAS 67-63-0)、無水乙醇(CAS 64-17-5)均購自國藥集團化學試劑有限公司，為國產(chǎn)分析純級。

1.2 大型溞的培養(yǎng)

大型溞溞種來自南京大學環(huán)境學院，實驗開始前在本實驗室恒溫光照培養(yǎng)箱中至少連續(xù)穩(wěn)定培養(yǎng)了10代。大型溞培養(yǎng)溫度為22 ℃±1 ℃，光暗比為16 h∶8 h。參考之前的相關研究中大型溞的培養(yǎng)方案，除氯自來水適用于大型溞的養(yǎng)殖[16-18]。本研究大型溞的培養(yǎng)液為經(jīng)安吉爾凈水器(J1205-ROB12)過濾后，連續(xù)曝氣48 h除氯的自來水，曝氣后溶氧含量為8.6 mg·L-1，在此培養(yǎng)液中大型溞生長狀態(tài)良好、個體活躍。喂食小球藻(Chlorellapyrenoidesa)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)混合液，喂食密度為產(chǎn)溞前2.5×106cell·mL-1，產(chǎn)溞后5×106cell·mL-1，每天上午9:00喂食一次。每隔一天更換一次培養(yǎng)液。

在本研究培養(yǎng)條件下大型溞只營孤雌生殖。孤雌生殖是大型溞在營養(yǎng)狀況良好的條件下所營的一種無性生殖方式，由大型溞卵巢內(nèi)的干細胞均等分裂生成卵母細胞進而發(fā)育成雌性個體[19]，此繁殖方式有利于大型溞迅速擴大種群[20]。在孤雌生殖模式下，大型溞能保持遺傳的穩(wěn)定性和基因的純凈性，個體差異較小使毒理學研究能在可重復和統(tǒng)一的實驗條件下開展[21]。此外孤雌生殖模式下大型溞繁殖周期短、子代產(chǎn)量大，使實驗材料的獲取更為便捷。而有性生殖是大型溞在營養(yǎng)狀況不良條件下的生殖方式，產(chǎn)生的卵鞍需要在適宜條件下孵化才能發(fā)育成幼溞，此種繁殖方式是大型溞為渡過不良環(huán)境所進行的，出現(xiàn)有性生殖說明大型溞受到了環(huán)境脅迫，是一種不健康的狀態(tài)[22]，不適用于開展毒理學研究。在本研究中大型溞的所有子代均由孤雌生殖得到。

1.3 綠藻的培養(yǎng)與收集

小球藻和斜生柵藻藻種來自中國科學院水生生物研究所，使用BG11液體培養(yǎng)基在恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。BG11液體培養(yǎng)基配方如表1和表2所示。在接種第7天綠藻生長達到平臺期，在此時收集綠藻。將收取的2種新鮮藻液按照1∶1的比例置于50 mL離心管內(nèi)，配平后置于高溫冷凍離心機內(nèi)，20 ℃、8 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，加入適量純水，將沉淀搖勻后重復進行離心，洗滌2次之后，加入適量純水，搖勻后用細胞計數(shù)儀(Cellometer Mini, Nexcelom，美國)測定綠藻細胞密度，適當稀釋至所需密度后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 BG11液體培養(yǎng)基配方Table 1 The formulation of BG11 medium

表2 A5痕量金屬溶液配方Table 2 The formulation of A5 trace metal solution medium

1.4 實驗設計

1.4.1 4,4’-DDT濃度設置及母液配制

本研究以4,4’-DDT的CCC為標準，在高于其一個數(shù)量級和低于其一個數(shù)量級分別設置一個濃度梯度，從而比較LOEC與暴露時間之間的關系。之前的研究表明暴露時間延長可能使LOEC在數(shù)量級上降低，設置濃度梯度能探究4,4’-DDT全生命周期暴露是否也存在這種現(xiàn)象，從而揭示其是否能準確評估化學污染物的環(huán)境風險[12]。4,4’-DDT的CCC為1 ng·L-1，據(jù)此本研究選取10 ng·L-1為最高濃度，1 ng·L-1為次高濃度，0.1 ng·L-1為最低濃度，每個濃度設置3個平行，同時設置一個溶劑對照組。之前的研究表明，體積分數(shù)為0.01%的DMSO不會對大型溞造成毒性效應，因此本研究以溶劑對照作為空白對照[12]。暴露液的體積為1 000 mL，為了保證對照組DMSO的體積分數(shù)為0.01%，加入母液的體積應為100 μL。

4,4’-DDT原液的濃度為100 ng·μL-1，先吸取50 μL原液于棕色玻璃瓶內(nèi)，加入950 μL DMSO，配制成5 000 ng·mL-1的母液，然后將其稀釋5倍，得到1 000 ng·mL-1的母液，然后將母液按照梯度稀釋的方法依次稀釋，得到100、10和1 ng·mL-1的母液。將這3個濃度的母液吸取100 μL加入1 000 mL的暴露液中，得到4,4’-DDT的濃度即為10、1和0.1 ng·L-1，對照組加入等體積DMSO。

1.4.2 全生命周期暴露取樣時間點的確定

根據(jù)之前繪制的大型溞全生命周期特征曲線[12]，將大型溞的全生命周期分為生長階段(0～12 d)、繁殖階段(13～53 d)和死亡階段(54 d～自然死亡)。為了與21 d慢性毒性測試作比較，選擇的取樣時間點分別為第6天、第21天、第32天和第55天，其中第6天、第32天和第55天分別是生長、繁殖和死亡階段的代表性取樣時間點。

1.4.3 4,4’-DDT對大型溞全生命周期暴露及取樣

暴露實驗使用1 000 mL的圓底燒杯，暴露培養(yǎng)液與日常培養(yǎng)保持一致，每個燒杯中盛入1 000 mL連續(xù)曝氣48 h的過濾自來水和50只出生<12 h的幼溞，保證每只幼溞所占的平均體積為20 mL。在暴露體系中加入不同濃度的4,4’-DDT母液，使體系中4,4’-DDT的濃度達到設定值，在空白對照中加入等體積的DMSO。在恒溫光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與日常培養(yǎng)保持一致，每天喂食一次，每隔一天換水一次，每次換水完成后都隨機打亂燒杯在培養(yǎng)箱內(nèi)的位置，排除光照不勻等因素對實驗造成的誤差。

從暴露的第0天起，每天觀測對照組和暴露組大型溞的生長、繁殖和存活情況，并記錄每個燒杯內(nèi)存活的大型溞個數(shù)和每天新產(chǎn)出的子代總個數(shù)，每日新產(chǎn)出的子代在計數(shù)完成后需移出培養(yǎng)體系。在暴露的第6天、第21天、第32天和第55天，取樣前需先測定大型溞F0代和F1代的體長(從頭盔至尾巴基部的長度)、大型溞的心率和行為參數(shù)。體長測量方法為：從每個燒杯內(nèi)隨機取8只大型溞，使用軟件Image Pro Plus和LEICA DFC450C(德國)拍照并測量體長，記為F0代體長。收集取樣當日新產(chǎn)出的子代(<24 h)10只，測量體長，記為F1代體長。心率的測定方法為：從每只燒杯內(nèi)隨機選取3只大型溞，使用LEICA DFC450C(德國)和Camtasia Studio軟件，待大型溞心率平穩(wěn)后，在顯微鏡下將大型溞的心臟搏動拍攝為視頻(50 f·s-1)，然后以慢動作播放視頻并計數(shù)60 s內(nèi)的心跳次數(shù)。行為參數(shù)測定方法為：用動物行為儀DanioVision(Noldus，荷蘭)監(jiān)測并拍攝大型溞在1 h內(nèi)(40 min光照+20 min黑暗)的水平游泳軌跡，隨后用Ethovision XT 13軟件分析計算其水平方向的游泳速度。由于本研究中大型溞的行為測定采用的是二維成像系統(tǒng)，為了最大程度消除垂直運動的影響，測定行為參數(shù)時選取的水深在不影響大型溞正常游動的情況下盡可能小，以限制大型溞在垂直方向上的運動，之前的幾項研究也是通過在扁平的容器內(nèi)進行檢測以消除大型溞垂直方向運動的影響[23-25]。本研究均采取10 mm水深，大型溞的垂直運動可忽略不計。

各項指標測定結束后對大型溞進行取樣，為了保證能提取足量的總RNA，根據(jù)大型溞個體大小的差異，在第6天、第21天、第32天和第55天所取樣本數(shù)分別為15、10、5和5只。將大型溞樣本取至做好標記的RNAase-free EP管內(nèi)，充分吸干水分后加入600 μL TRIzol和4～5顆勻漿鋼珠，用細胞破碎儀勻漿后置于-80 ℃凍存。

1.4.4 大型溞的階段特異性PCR array

本研究基因轉(zhuǎn)錄的檢測采用先前建立的大型溞階段特異性PCR array[12]。簡言之，將大型溞的全生命周期分為為出生階段、生長階段、繁殖階段和死亡階段。據(jù)推測，當大型溞從某一個生命階段進入下一個生命階段時，一些基因的轉(zhuǎn)錄將被上調(diào)以實現(xiàn)下一階段的生物學功能。因此采用轉(zhuǎn)錄組測序手段篩選每2個連續(xù)的生命階段之間上調(diào)的基因，開發(fā)大型溞的階段特異性的PCR array。在以往的研究中，類似的假設也常被用來篩選具有階段特異性功能的基因[26-27]。在本研究中，大型溞階段特異性PCR array的開發(fā)步驟為：(1)分別獲取第0天與第6天、第6天與第32天以及第32天與第62天之間的差異轉(zhuǎn)錄基因，并且對差異性上調(diào)的所有基因進行KEGG pathway分析，得到第0天與第6天、第6天與第32天以及第32天與第62天之間顯著性上調(diào)的所有代謝通路，分別定義為生長、繁殖和死亡階段的關鍵通路；(2)將3個階段的所有關鍵通路按照富集因子(rich factor, RF)值從大到小排序；(3)選取每個階段中RF排名前五的代謝通路進行重點研究，在每條代謝通路中，選取基因倍數(shù)變化(fold change)最大的5個基因(readcount≥10)構建大型溞的階段特異性PCR array。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘出在4個取樣時間點轉(zhuǎn)錄均維持穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因(internal control)，本研究的內(nèi)參基因為bcl2(hypothetical protein DAPPUDRAFT_311135 )。據(jù)此開發(fā)的大型溞階段特異性PCR array中所包含的基因及詳細信息列在表3中。

表3 大型溞階段特異性PCR array包含的代謝通路及基因Table 3 List of genes and corresponding pathways in the developed stage-specific PCR array of Daphnia magna

1.4.5 實時熒光定量PCR檢測

分別使用第6天、第32天和第55天的大型溞樣品檢測階段特異性PCR array中生長階段、繁殖階段和死亡階段關鍵基因的轉(zhuǎn)錄情況?？俁NA的提取采用TRIzol法，RNA濃度和純度的檢測使用Epoch Microplate分光光度計(BioTek Instruments, Inc，美國)，檢測RNA樣品在260 nm/280 nm波長下的比值，若該比值在1.90～2.10之間，則確定所得RNA純度較高，可用于反轉(zhuǎn)錄，RNA濃度的測定是根據(jù)樣品在260 nm波長下的光吸收度來確定的。反轉(zhuǎn)錄使用Prime Script RT reagent kits (Takara公司，大連，中國)試劑，所使用RNA的量為500 ng，根據(jù)試劑盒的步驟將所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，各試劑用量如下：5X Prime Script Buffer (for Real time) 2 μL，Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo Dt Primer (50 μmol·L-1) 0.5 μL，Random 6 mers (100 μmol·L-1) 0.5 μL，RNase Free dH2O 1.5 μL，Total RNA 5 μL。加樣完成并離心后放置于PCR儀中進行反轉(zhuǎn)錄，PCR儀反應條件設置為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反應完成后得到cDNA。稀釋20倍后可用于實時熒光定量PCR檢測。實時熒光定量PCR檢測使用SYBR Green Primex Ex TaqⅡ kits (Takara公司，大連，中國)試劑。各試劑用量如下：SYBR Green Mix試劑10 μL，DEPC水6 μL，Rox Reference Dye試劑0.4 μL，Primer F 0.8 μL，Primer R 0.8 μL，cDNA 2 μL。基因引物的設計使用的是Primer Premier 6軟件，擴增條件設置為：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；共計40個循環(huán)。與之前的研究[12, 28]相同，本研究數(shù)據(jù)采用CT值計算，采用2-△△CT法分析，最后將轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)以fold change形式呈現(xiàn)。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析與處理

本研究中數(shù)據(jù)分析使用Kyplot Demo 3.0 (Tokyo, Japan)軟件，參數(shù)方差的正態(tài)性和同質(zhì)性分別使用Kolmogorov-Smirnov和Levene’s檢驗。處理組與對照組之間差異性的檢驗使用的是one-way analysis of variance，在本實驗中所有分析的顯著性水平設置為P<0.05。

2 結果(Results)

2.1 4,4’-DDT全生命周期暴露對大型溞生長的影響

F0代的體長是大型溞的生長指標。如圖1所示，與對照組相比，0.1、1和10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露對大型溞F0代的體長在第6天、第21天、第32天和第55天均沒有產(chǎn)生顯著性的影響。

圖1 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第6天、第21天、 第32天和第55天對大型溞F0代體長的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤。Fig. 1 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the body length of Daphnia magna of F0 generation after exposure to 4,4’-DDT for 6, 21, 32 or 55 dNote: Data was represented by mean±standard deviation.

2.2 4,4’-DDT全生命周期暴露對大型溞生殖的影響

本研究大型溞的子代全部由孤雌生殖得到，整個實驗過程中未出現(xiàn)有性生殖現(xiàn)象。大型溞的生殖指標包括平均累積產(chǎn)溞數(shù)和F1代體長，分別為生殖數(shù)量和生殖質(zhì)量的指標，綜合體現(xiàn)大型溞的繁殖力。如圖2(a)所示，與對照組相比，0.1、1和10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露對大型溞的平均累積產(chǎn)溞數(shù)沒有顯著性影響。由圖2(b)可知，與對照組相比，10 ng·L-1的4,4’-DDT在暴露第21天、第32天和第55天均顯著性降低了F1代體長，在這3個時間點體長降低的百分比分別為4.00%、2.70%和3.32%。其余2個濃度組對F1代體長沒有顯著性影響。

圖2 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)全生命周期暴露對大型溞生殖的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤，*代表P<0.05，與對照組相比有顯著性差異。Fig. 2 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the reproduction of Daphnia magna after the whole-life-stage exposureNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

2.3 4,4’-DDT全生命周期暴露對大型溞心率的影響

如圖3所示，4,4’-DDT全生命周期暴露顯著性改變了大型溞的心率。在暴露的第6天和第21天，大型溞的心率在1 ng·L-1和10 ng·L-1濃度組出現(xiàn)了顯著性的增加，其他濃度組沒有顯著性效應；而在第32天和第55天，0.1 ng·L-1的4,4’-DDT對其心率也產(chǎn)生了顯著性影響。由此可見，4,4’-DDT對大型溞心率的LOEC在不同的生命階段出現(xiàn)了變化，隨著暴露時間的延長，LOEC從第21天的1 ng·L-1降低為第32天的0.1 ng·L-1，降低了一個數(shù)量級。

圖3 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第6天、 第21天、第32天和第55天對大型溞心率的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤，*代表P<0.05， 與對照組相比有顯著性差異。Fig. 3 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the heart rate of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 6, 21, 32 or 55 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

2.4 4,4’-DDT全生命周期暴露對大型溞行為的影響

由圖4可知，4,4’-DDT在不同的生命階段對大型溞游泳速度的影響是不同的。在暴露第6天，4,4’-DDT顯著性增加大型溞的游泳速度，LOEC為0.1 ng·L-1；在第21天，4,4’-DDT對大型溞的游泳速度沒有顯著性影響；在第32天和第55天，大型溞的游泳速度在4,4’-DDT作用下出現(xiàn)了顯著性降低，LOEC均為0.1 ng·L-1。由此可見，隨著暴露時間的延長，4,4’-DDT對大型溞游泳行為的影響從促進到無影響到抑制，促進和抑制作用的LOEC均為0.1 ng·L-1。

圖4 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第6天、 第21天、第32天和第55天對大型溞行為的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤，*代表P<0.05，與對 照組相比有顯著性差異。Fig. 4 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the swimming speed of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 6, 21, 32 or 55 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

2.5 4,4’-DDT全生命周期暴露對大型溞存活的影響

如圖5所示，與對照組相比，0.1、1和10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露在第6天、第21天、第32天和第55天對大型溞的存活率均沒有產(chǎn)生顯著性影響。對照組與暴露組的存活率均在暴露第89天降為0%。

圖5 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)全生命周期 暴露對大型溞存活的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤。Fig. 5 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the survival rate of Daphnia magna after the whole-life-stage exposureNote: Data was represented by mean±standard deviation.

2.6 4,4’-DDT全生命周期暴露對大型溞基因轉(zhuǎn)錄的影響

圖6顯示了4,4’-DDT暴露對大型溞階段特異性PCR array中生長關鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響。在生長階段的17個關鍵基因中，與對照組相比，有11個基因的轉(zhuǎn)錄在4,4’-DDT暴露后發(fā)生了顯著性變化，這11個基因分布在5條代謝通路中。其中，同源重組(homologous recombination)通路中包含5個基因，分別是rpa1 (DNA-directed RNA polymerase Ⅰ subunit RPA1)、pold1 (DNA polymerase delta subunit 1)、rad54l(DNA repair and recombination protein RAD54 and RAD54-like protein)、rad52 (DNA repair and recombination protein RAD52)、mre11 (double-strand break repair protein MRE11)。其中，rpa1和pold1在10 ng·L-14,4’-DDT暴露下轉(zhuǎn)錄顯著性上調(diào)，rad54l、rad52和mre11在1 ng·L-1或10 ng·L-14,4’-DDT暴露下轉(zhuǎn)錄顯著性下調(diào)。在DNA復制(DNA replication)通路中，rnaseh1(ribonuclease HI)和rfc3_5 (replication factor C subunit 3/5)的轉(zhuǎn)錄被顯著性下調(diào)，而pold1的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)上調(diào)；在錯配修復(mismatch repair)代謝通路中，rpa1和pold1的轉(zhuǎn)錄被顯著性上調(diào)而msh6 (DNA mismatch repair protein MSH6)和rfc3_5的轉(zhuǎn)錄被下調(diào)；在核苷酸切除修復(nucleotide excision repair)通路中，除了pold1的轉(zhuǎn)錄在4,4’-DDT作用下被上調(diào)之外，msh6和rfc3_5的轉(zhuǎn)錄均是被顯著性下調(diào)的；在細胞溶質(zhì)DNA傳感途徑(cytosolic DNA-sensing pathway)中，有3個基因的轉(zhuǎn)錄均出現(xiàn)顯著性降低，分別為rpc1_2 (DNA-directed RNA polymerase Ⅲ subunit RPC1)、rpc3 (DNA-directed RNA polymerase Ⅲ subunit RPC3)和rpc1_4 (DNA-directed RNA polymerase Ⅲ subunit RPC1)。

圖6 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第6天對大型溞生長關鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤，*代表P<0.05，與對照組相比有顯著性差異。Fig. 6 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the vital gene transcriptions at the growth stage of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 6 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

總體而言，在這11個轉(zhuǎn)錄被顯著性改變的基因中，只有2個基因的轉(zhuǎn)錄是顯著性上調(diào)，另外9個基因在4,4’-DDT作用下均出現(xiàn)顯著性下調(diào)轉(zhuǎn)錄。

圖7顯示了4,4’-DDT暴露對大型溞階段特異性PCR array中生殖關鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響。在生殖階段的24個基因中有6個基因的轉(zhuǎn)錄在4,4’-DDT暴露下出現(xiàn)顯著性變化，其中hspa1_8_3 (heat shock 70 kDa protein 1/8)的轉(zhuǎn)錄顯著性上調(diào)，abl1 (abelson tyrosine-protein kinase 1)、pik3c(phosphatidylinositol 3-kinase)、prom1 (prominin 1)、sgrap(RAS guanyl-releasing protein 1)和ptch1 (patched 1)的轉(zhuǎn)錄顯著性降低。這6個基因分布在4條代謝通路中，分別是慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)(transcriptional misregulation in cancer)通路、剪接體(spliceosome)通路和軸突導向(axon guidance)通路。

圖7 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第32天對大型溞生殖關鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤，*代表P<0.05，與對照組相比有顯著性差異。Fig. 7 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the vital gene transcriptions at the reproduction stage of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 32 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

圖8顯示了4,4’-DDT暴露對大型溞階段特異性PCR array中死亡關鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響。在死亡階段的18個基因中，有5個基因的轉(zhuǎn)錄在0.1、1或10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露下出現(xiàn)了顯著性上調(diào)，分別為sgcd(delta-sarcoglycan)、glra1 (glycine receptor alpha)、takr2 (tachykinin-like receptor)、crhr1 (corticotropin releasing hormone receptor 1)和ddc(aromatic-L-amino-acid decarboxylase)，1個基因的轉(zhuǎn)錄被顯著性下調(diào)，為actb_g1 (actin beta/gamma 1)。其中上調(diào)的基因主要集中在擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy)和神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuro active ligand-receptor interaction)這2條代謝通路中。

圖8 4,4’-DDT(0.1、1和10 ng·L-1)暴露第55天對大型溞死亡關鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤，*代表P<0.05，與對照組相比有顯著性差異。Fig. 8 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the vital gene transcriptions at the death stage of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 55 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

3 討論(Discussion)

本研究采用先前建立的大型溞全生命周期毒性評估方法[12]，選取美國環(huán)境保護局水質(zhì)基準文件中的環(huán)境持久性污染物4,4’-DDT為受試化學污染物及其基準連續(xù)濃度為暴露濃度，以毒理學模式生物大型溞為模型開展全生命周期暴露實驗，研究依據(jù)部分生命周期毒理學數(shù)據(jù)得出的污染物閾值濃度在全生命周期暴露下對水生生物是否會造成毒性效應。采用已開發(fā)的大型溞階段特異性PCR array探究4,4’-DDT對不同生命階段關鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響。當一條代謝通路中至少有一半基因或者數(shù)目≥3個基因的轉(zhuǎn)錄在化學污染物的影響下發(fā)生顯著性變化時，即認為其是受主要影響的代謝通路[28]，在本研究中采取同樣的規(guī)定。

體長是大型溞的生長指標，大型溞快速生長期為出生后的0～12 d，隨后體長增長減緩并逐漸趨于穩(wěn)定，到達平臺期。本研究中，10 ng·L-1及更低濃度的4,4’-DDT全生命周期暴露對大型溞的體長沒有產(chǎn)生顯著性影響，說明該濃度不足以對大型溞造成發(fā)育毒性。以往的研究表明，當4,4’-DDT的濃度超過50 ng·L-1時才會使斑馬魚的體長出現(xiàn)顯著性降低[29]，另一項研究表明，1 μg·L-1的4,4’-DDT暴露對大型溞的生長并沒有產(chǎn)生顯著性的影響[30]。由此可見，4,4’-DDT對大型溞的發(fā)育毒性較低，美國環(huán)境保護局水質(zhì)基準中制定的CCC(1 ng·L-1)對于大型溞的生長沒有產(chǎn)生毒性效應。此外，大型溞生長階段的5條關鍵代謝通路在4,4’-DDT暴露下均受到了主要影響，其中同源重組(homologous recombination)、DNA復制(DNA replication)、錯配修復(mismatch repair)和核苷酸切除修復(nucleotide excision repair)這4條通路內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄既有上調(diào)也有下調(diào)；而細胞溶質(zhì)DNA傳感(cytosolic DNA-sensing pathway)途徑包含的5個基因中有3個的轉(zhuǎn)錄在1 ng·L-1或10 ng·L-14,4’-DDT作用下出現(xiàn)顯著性下調(diào)。細胞溶質(zhì)DNA傳感(cytosolic DNA-sensing pathway)途徑中，細胞內(nèi)模式識別受體的特定家族負責檢測來自入侵微生物或宿主細胞的外源DNA，并產(chǎn)生先天免疫應答[31-32]，該途徑與生物的先天免疫能力緊密相關，對大型溞個體的正常發(fā)育至關重要。研究表明，1 ng·L-1或10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露顯著性抑制了大型溞免疫相關途徑中基因的轉(zhuǎn)錄，雖然沒有造成發(fā)育毒性，但可能在一定程度上降低了機體的免疫能力。

在生殖方面，10 ng·L-1的4,4’-DDT濃度組F1代體長出現(xiàn)顯著性降低，這說明大型溞的繁殖力降低。一般而言，大型溞投入繁殖活動的總能量是固定的，在產(chǎn)溞總數(shù)不變的情況下，為降低總繁殖成本，只能減小子代個體。在食物、溫度等外界條件不變的前提下，污染物的脅迫是導致大型溞降低繁殖成本的主導因素。此外，較小的個體在環(huán)境中存活的風險更高。因此，10 ng·L-1的4,4’-DDT對大型溞造成了一定的生殖毒性。從基因轉(zhuǎn)錄的結果來看，沒有受主要影響的代謝通路存在。因此10 ng·L-1的4,4’-DDT對大型溞的生殖毒性可能主要來源于4,4’-DDT脅迫下的應激反應，美國環(huán)境保護局水質(zhì)基準制定的CCC(1 ng·L-1)對于大型溞的生殖沒有產(chǎn)生毒性效應。

心率和行為是大型溞毒理學研究中比較敏感的2個指標，經(jīng)常被用于各種污染物的毒性檢測中，近些年相關的研究也得到廣泛開展[33-35]。大型溞的心臟位于其頭部后方的背側，其心臟壁和殼瓣均為透明的，心臟搏動可通過顯微鏡清晰地觀察到[36]。大型溞的游泳行為受到生理、感知、神經(jīng)和肌肉等多方面的影響，并且與其捕食、逃避天敵等行為直接相關[37-38]。這2個生理指標能夠更敏感地指示一些環(huán)境濃度化學污染物對大型溞的毒性效應，也能作為大型溞的毒性測試中生理指標的補充，在對一些持久性環(huán)境污染物進行環(huán)境風險評估與環(huán)境基準制定時應予以考慮。大型溞有著與哺乳動物類似的肌源性心臟(myogenic heart)，其心率對許多污染物表現(xiàn)出的反應與哺乳動物相似[39]。其起搏機制與一組獨特的離子通道有關，包括超極化激活、環(huán)核苷酸門控(HCN)和T型鈣離子通道[40]。心率的變化能夠反映出污染物對水生生物能量代謝的影響以及污染物進入血液循環(huán)系統(tǒng)的程度[41]。許多研究表明，外源物質(zhì)能夠顯著性影響大型溞的心率，且不同的物質(zhì)表現(xiàn)出的反應不同[41-42]。例如，尼古丁暴露能降低大型溞的心率，而乙醇則能增加其心率[43]。此外，全氟辛烷磺酸(PFOS)會導致大型溞心律失常[44]。我們之前的研究也表明，磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)暴露后大型溞可能死于心臟功能的喪失，并且TDCIPP能夠加速心臟功能喪失的進程[12]。本研究中，4,4’-DDT暴露導致大型溞心率的增加可能與其代謝增強相關，機體增加基礎代謝從而抵御4,4’-DDT的脅迫。并且隨著暴露時間的延長，LOEC的降低說明4,4’-DDT在大型溞體內(nèi)的不斷累積，對大型溞的毒性增強。之前的研究也指出，DDT在大型溞體內(nèi)具有一定的生物累積性，隨著暴露時間的延長，其在大型溞體內(nèi)的濃度會逐漸升高，并且隨著時間的延長，最終濃度可達到幾千mg·kg-1[45]。在本研究中，即使是最低濃度的4,4’-DDT(0.1 ng·L-1)也會對大型溞的心率造成顯著性影響，說明心率比生長生殖指標更加敏感。研究表明，大型溞的游泳速度隨著體長的增長而增加[46]，因此影響體長的因素可能也會影響大型溞的游泳速度[24]。本研究中大型溞的體長沒有發(fā)生顯著性變化，因此其體長不是影響游泳速度的因素。有研究發(fā)現(xiàn)，蚤狀溞(Daphniapulex)的游泳速度隨著污染物暴露時間的延長，會先上升到一個峰值，然后降低，這可能是對污染物脅迫短時間內(nèi)的反應[47]。4,4’-DDT對大型溞游泳速度的影響也是先促進后抑制，并且LOEC均為0.1 ng·L-1。與心率一樣，行為參數(shù)也比生長和生殖指標更為敏感，因此對于心率和行為而言，美國環(huán)境保護局水質(zhì)基準制定的CCC(1 ng·L-1)在全生命周期暴露下對大型溞表現(xiàn)出一定毒性效應。

在存活方面，10 ng·L-1及較低濃度的4,4’-DDT暴露并沒有影響大型溞的平均壽命。之前一項急性毒性研究表明，4,4’-DDT對大型溞14 d的半數(shù)致死濃度(lethal concentration 50%, LC50)為670 ng·L-1[48]，本研究所設置的濃度相對較低，沒有對大型溞產(chǎn)生致死性。死亡階段基因轉(zhuǎn)錄的結果顯示，在4,4’-DDT作用下受主要影響的代謝通路只有神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，該通路是質(zhì)膜上所有與細胞內(nèi)外信號通路相關的受體和配體的集合[49]，說明4,4’-DDT暴露對大型溞死亡階段的細胞信號傳導具有一定干擾作用。但是總體而言，美國環(huán)境保護局水質(zhì)基準制定的CCC(1 ng·L-1)對大型溞的存活沒有造成顯著性毒性效應。

總而言之，美國環(huán)境保護局水質(zhì)基準中對4,4’-DDT制定的CCC在全生命周期暴露下對大型溞的生長、生殖和存活均未造成顯著性毒性效應，但是對其心率和行為會造成顯著的毒性效應。基因轉(zhuǎn)錄結果表明，4,4’-DDT在生長階段和死亡階段分別改變了大型溞與免疫功能和細胞信號傳導功能相關代謝通路中基因的轉(zhuǎn)錄。此外對于心率而言，隨著暴露時間延長，其LOEC從第21天的1 ng·L-1降低至第32天的0.1 ng·L-1，說明即使在0.1 ng·L-1暴露條件下仍然能夠觀察到4,4’-DDT對大型溞的毒性效應。因此在對一些持久性環(huán)境污染物進行環(huán)境風險評估與環(huán)境基準制定時，全生命周期毒性測試應得到適當考慮。