賴桂花 王菲 周芳 向婷婷 文玲 伍卓珺 曹建雄

〔摘要〕 目的 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療骨轉(zhuǎn)移癌痛的作用機(jī)制。方法 通過(guò)文獻(xiàn)查找、TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂的活性成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得骨轉(zhuǎn)移癌痛相關(guān)的靶點(diǎn)，利用Venn在線軟件獲取“化合物-疾病”共同靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)繪制核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，利用DAVID對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析，最后使用Auto Dockt Vina對(duì)骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂關(guān)鍵化學(xué)成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果 骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂關(guān)鍵化合物為豆甾醇、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素等，核心作用靶點(diǎn)涉及AKT1、TP53、IL-6等;GO生物學(xué)過(guò)程分析表明骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂活性成分的基因功能主要表現(xiàn)在RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等過(guò)程，KEGG結(jié)果表明骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂主要作用與AKT1、TP53、IL-6等核心靶點(diǎn)和癌癥通路等信號(hào)通路有關(guān)。分子對(duì)接結(jié)果表明豆甾醇、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素與AKT1、TP53、IL-6有很好的結(jié)合能力。結(jié)論 骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂活性成分豆甾醇、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素可能通過(guò)癌癥通路等信號(hào)通路作用于AKT1、TP53、IL-6等關(guān)鍵靶點(diǎn)而發(fā)揮治療骨轉(zhuǎn)移癌痛的功效。

〔關(guān)鍵詞〕 骨轉(zhuǎn)移癌痛;骨碎補(bǔ);補(bǔ)骨脂;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接

〔中圖分類號(hào)〕R285? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.011

Mechanism of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） Drug Pair on Treatment of Bone Metastasis Cancer Pain Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

LAI Guihua1， WANG Fei1， ZHOU Fang1， XIANG Tingting1， WEN Ling1， WU Zhuojun1， CAO Jianxiong1，2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To use network pharmacology and molecular docking technology to explore the mechanism of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） for the treatment of bone metastasis cancer pain. Methods Through literature search， TCMSP database and BATMAN-TCM database， the active ingredients of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） and their corresponding targets were obtained， the targets related to bone metastasis cancer pain were obtained through GeneCards database， and the "compound-disease" common targets were obtained by using Venn online software. Cytoscape 3.7.1 software was used to construct “Chinese medicine-compound-target-disease” network diagram， STRING database was used to draw core target PPI network， DAVID was used to perform GO function and KEGG pathway enrichment of core target. Auto Dockt Vina was used to verify the molecular docking between the key chemical components of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） and their core target. Results The key compounds of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） were stigmasterol， isopsoralen， bakuchiol， kaempferol， β-sitosterol， luteolin， etc. The core targets involved AKT1， TP53， IL-6， etc. GO biological process analysis showed that the gene function of the active ingredients of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） was mainly manifested in the positive regulation of RNA polymerase II promoter， signal transduction， and positive regulation of cell proliferation. The results of KEGG showed the main role of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） was related to AKT1， TP53， IL-6 and other core targets and cancer signaling pathways. The molecular docking results showed that stigmasterol， isopsoralen， bakuchiol， kaempferol， β-sitosterol， luteolin had good binding ability with AKT1， TP53， and IL-6. Conclusion Active ingredients stigmasterol， isopsoralen， bakuchiol， kaempferol， β-sitosterol， luteolin of Gusuibu （Drynariae Rhizoma）-Buguzhi （Psoraleae Fructus） may act on AKT1， TP53， IL-6 and other key targets through signaling pathways such as cancer pathway to treat bone metastasis cancer pain.

〔Keywords〕 bone metastasis cancer pain; Gusuibu （Drynariae Rhizoma）; Buguzhi （Psoraleae Fructus）; network pharmacology; molecular docking

骨轉(zhuǎn)移癌痛（bone cancer pain， BCP）是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移到骨引起的疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其主要機(jī)制是由于腫瘤細(xì)胞的侵犯使骨穩(wěn)態(tài)失衡，骨質(zhì)得到破壞，引發(fā)BCP[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療主要以病因治療和對(duì)癥治療為主，對(duì)癥治療以止痛藥物為主，止痛效果明確，但由于耐藥、藥物副作用、心理因素和個(gè)體差異等多方面的原因，臨床治療效果并不滿意，同樣抗腫瘤等病因治療也未能取得理想的長(zhǎng)期治療效果[2-4]。如何對(duì)BCP進(jìn)行有效合理的治療，是當(dāng)今臨床亟需解決的問(wèn)題。臨床及現(xiàn)代藥理研究[5-7]證實(shí)，中醫(yī)藥治療BCP是有效、安全的，且在協(xié)同增效、降低西藥毒性等方面發(fā)揮重要的作用。筆者前期基于數(shù)據(jù)挖掘?qū)χ嗅t(yī)內(nèi)服方劑治療BCP文獻(xiàn)中的醫(yī)案及臨床研究進(jìn)行分析和研究，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂是中醫(yī)治療BCP方劑中頻率出現(xiàn)最高的組合[8]，其中骨碎補(bǔ)補(bǔ)腎強(qiáng)骨，補(bǔ)骨脂屬補(bǔ)腎壯陽(yáng)之要藥，兩者配伍治療BCP，可在補(bǔ)益肝腎精血的同時(shí)又溫化腎陽(yáng)，陰陽(yáng)雙補(bǔ)從而起到壯骨強(qiáng)筋之用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[9]表明，兩藥合用能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，拮抗破骨細(xì)胞的過(guò)度激活，對(duì)BCP具有良好的止痛作用。實(shí)驗(yàn)研究[10]表明，骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂具有類似雌激素作用，補(bǔ)骨脂具有抑制破骨細(xì)胞生成活性及減少溶骨性活動(dòng)的功能;而骨碎補(bǔ)則在增加成骨細(xì)胞生成方面作用更為明顯，兩者在方劑中配伍使用可協(xié)同增效、相互兼治，從微結(jié)構(gòu)改善骨組織、增加骨密度及增強(qiáng)骨質(zhì)量。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門綜合了生物學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)等多個(gè)學(xué)科的新興交叉學(xué)科，從整體水平、分子層面及多靶點(diǎn)、多通路深入探索藥物與疾病的關(guān)系，適應(yīng)中藥復(fù)方多靶點(diǎn)的特性，體現(xiàn)了中藥組方的系統(tǒng)性，有助于闡明中藥的藥理作用[11]。近年來(lái)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)中藥治療復(fù)雜性疾病的作用機(jī)制研究得到了中醫(yī)藥研究者的認(rèn)可和應(yīng)用[12]。因此，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，收集和分析疾病、藥物信息，從生物信息學(xué)角度探討骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP的可能作用機(jī)制，并采用分子對(duì)接對(duì)關(guān)鍵化合物和核心靶點(diǎn)進(jìn)行初步驗(yàn)證，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）收集骨碎補(bǔ)的化學(xué)成分，根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)（absorption、distribution、metabolism、excretion， ADME）的特點(diǎn)將口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件獲得主要活性成分[13]，并基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取骨碎補(bǔ)中篩選出活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。由于TCMSP中未收集補(bǔ)骨脂相關(guān)信息，在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中以“Bu Gu Zhi”（補(bǔ)骨脂）為檢索詞，“Herb”（草藥）為輸入格式，檢索Score Cutoff設(shè)置為20，以P<0.05為有效靶點(diǎn)預(yù)測(cè)置信區(qū)間，檢索獲得補(bǔ)骨脂的活性成分及其作用靶點(diǎn)信息。并根據(jù)文獻(xiàn)檢索增加骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂中有明確藥理活性的主要成分，將檢索所得各個(gè)主要成分于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相關(guān)靶點(diǎn)。最后通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https//www.uniprot.org/）將兩者藥物的靶點(diǎn)名稱統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化處理，標(biāo)準(zhǔn)化命名為基因名稱。

1.2? 骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂中活性化合物治療BCP的靶點(diǎn)映射

利用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）以“bone cancer pain”為關(guān)鍵詞篩選疾病BCP相關(guān)靶點(diǎn)基因。利用網(wǎng)絡(luò)在線繪圖軟件Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，將篩選出的骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂的作用靶點(diǎn)與獲取的BCP疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.3? 構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

將相關(guān)數(shù)據(jù)輸入到Cytoscape（Version 3.7.1）中，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。本研究通過(guò)自由度（degree）的大小來(lái)分析網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的degree值越大則其在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要，說(shuō)明其參與的生物功能越多，生物學(xué)重要性越強(qiáng)[14]。

1.4? 構(gòu)建交集靶點(diǎn)“蛋白與蛋白相互作用”網(wǎng)絡(luò)

采用在線STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂作用于BCP的靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。并將該P(yáng)PI導(dǎo)入Cytoscape

3.7.1的軟件中，利用該軟件的插件cytohubba，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)篩選關(guān)鍵靶基因。

1.5? GO富集分析與KEGG通路分析

將獲得的骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂作用于BCP的預(yù)測(cè)靶基因?qū)朐诰€的DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中（https：//david.ncifcrf. Gov），選擇“functional annotation”模塊進(jìn)行GO功能富集分析以了解靶點(diǎn)主要作用過(guò)程，KEGG通路分析觀察靶點(diǎn)在通路中的分布情況。GO富集分析由生物過(guò)程（biological process， BP）、細(xì)胞組分（cellular component， CC）和分子功能（molecular function， MF）3個(gè)部分組成，本研究中GO分析和KEGG分析均以P<0.05、FDR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[15]。

1.6? 主要潛在活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

為了驗(yàn)證靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，從“骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂”治療BCP作用靶點(diǎn)的PPI中選取核心活性化合物和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。通過(guò) PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載核心活性化合物2D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件，并借助 ChemDraw軟件繪其化學(xué)結(jié)構(gòu)式。使用Pymol軟件對(duì)原PDB文件進(jìn)行去除水和原配體處理，AutoDockTools 軟件為靶蛋白受體分子加極性氫，通過(guò)AutoDock Vina和Python腳本實(shí)現(xiàn)分子對(duì)接[16]。

2 結(jié)果

2.1? 骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂活性成分與相應(yīng)靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中查找出骨碎補(bǔ)的活性成分71個(gè)，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為限定條件篩選出活性成分18個(gè)（見(jiàn)表1），靶點(diǎn)105個(gè);在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得補(bǔ)骨脂化合物14個(gè)，靶點(diǎn)268個(gè)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索出苦參黃素為骨碎補(bǔ)的主要活性成分[17]，另外黃芪苷、亞油酸、花翠素、補(bǔ)骨脂寧為補(bǔ)骨脂主要活性成分[18];但根據(jù)藥物ADME對(duì)文獻(xiàn)來(lái)源的有效化合物進(jìn)行篩選，因OB與DL值過(guò)小未符合篩選條件，故不將其納入。

2.2? 成分和疾病共同靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)GeenCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到BCP相關(guān)靶點(diǎn)8 935個(gè)，使用Venny2.1軟件將骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂的活性化合物對(duì)應(yīng)的353個(gè)藥物靶點(diǎn)與BCP對(duì)8 935個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集，通過(guò)Venn圖的形式得到296個(gè)共同靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.3? “中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析

在Cytoscape 3.7.1軟件中導(dǎo)入骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂的活性成分、靶點(diǎn)及BCP相關(guān)靶標(biāo)，構(gòu)建“藥物-疾病-成分-靶標(biāo)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，圖中可知網(wǎng)絡(luò)中共包括節(jié)點(diǎn)397個(gè)，邊1 105條。其中代表疾病的節(jié)點(diǎn)1個(gè)，代表藥物的節(jié)點(diǎn)2個(gè)，代表化合物的節(jié)點(diǎn)30個(gè)，代表疾病-藥物交集的靶點(diǎn)296個(gè)。見(jiàn)圖2。

2.4? PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將中藥-疾病映射靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，建立“骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂—BCP”靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，共得到296個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 376條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為 22.9;再將該結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以degree值≥46（根據(jù)degree平均值的倍數(shù)）為篩選標(biāo)準(zhǔn)，并刪除與骨轉(zhuǎn)移癌痛無(wú)關(guān)的靶點(diǎn)，得到24個(gè)核心靶點(diǎn)，處于核心位置的靶點(diǎn)（排名前10）有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、抑癌基因TP53、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、雌激素受體（ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、原癌基因JUN、腫瘤壞死因子（TNF），提示這些靶點(diǎn)蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。見(jiàn)圖3。

2.5? GO富集分析與KEGG通路富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中GO富集分析表明，骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP共涉及到395個(gè)BP，57個(gè)CC以及96個(gè)MF，BP中主要是對(duì)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、細(xì)胞增殖的正調(diào)控（positive regulation of cell proliferation）等生物過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)。CC中主要是對(duì)質(zhì)膜（plasma membrane）、細(xì)胞核（nucleus）、細(xì)胞質(zhì)（cytosol）等細(xì)胞組分有顯著作用。MF中主要是對(duì)蛋白結(jié)合（protein binding）、ATP結(jié)合（ATP binding）、鋅離子結(jié)合（zincion binding）等分子功能有顯著作用。本研究分別依據(jù)P值大小篩選排名前20位的 BP結(jié)果繪制氣泡圖，見(jiàn)圖4。

KEGG 通路富集分析表明，骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP共涉及134條通路。富集靶基因最多的10條通路依次為癌癥（pathways in cancer）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號(hào)通路（calcium signaling pathway）、cAMP信號(hào)通路（cAMP signaling pathway）、乙型肝炎（hepatitis B）、非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease）、cGMP-PKG信號(hào)通路（cGMP-PKG signaling pathway3）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、多巴胺能突觸（dopaminergic synapse）、恰加斯?。–hagas disease）、心肌細(xì)胞的腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)（adrenergic signaling in cardiomyocytes）。見(jiàn)圖5。

2.6? 核心活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接分析

將關(guān)鍵化合物為豆甾醇、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素與靶點(diǎn)AKT1、TP53、IL-6進(jìn)行分子對(duì)接（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明6個(gè)化合物與3個(gè)核心靶點(diǎn)均有有較好的結(jié)合能力，其中stigmasterol與AKT1的對(duì)接效果最好。見(jiàn)圖6。

3 討論

從本研究可知骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂中不同的靶標(biāo)可對(duì)應(yīng)相同的活性成分，同一靶標(biāo)也可與不同的活性成分相對(duì)應(yīng)，且30個(gè)活性化合物中每個(gè)化合物都至少與2個(gè)疾病靶點(diǎn)相互作用，可見(jiàn)骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。該藥對(duì)治療BCP主要是木犀草素、山柰酚等黃酮類化合物及其苷類化合物，豆甾醇和β-谷甾醇等甾體類化合物以及異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚等香豆素類化合物。研究[19]表明木犀草素和山柰酚不僅具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性，而且還具有較好的保護(hù)骨的作用。木犀草素可潛在抑制RANLRP3炎性小體過(guò)表達(dá)、進(jìn)一步降低Caspase-1、RANKL、VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)，并增強(qiáng)OPG蛋白表達(dá)起到骨關(guān)節(jié)保護(hù)作用[20]。山柰酚可通過(guò)mTORC1信號(hào)通路促進(jìn)牽張力下小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化[21]。豆甾醇和β-谷甾醇等甾體類化合物在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用[22]，實(shí)驗(yàn)研究[23]發(fā)現(xiàn)其在小鼠的多種急、慢性疼痛模型表現(xiàn)出有效的鎮(zhèn)痛作用，因此，甾體類化合物對(duì)于BCP可能具有良好的治療作用。補(bǔ)骨脂素近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于骨科疾病的治療，不僅能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化且能夠抑制破骨細(xì)胞分化[24-25]，從而起到防治骨科疾病的作用，對(duì)于骨癌痛中骨組織的破壞有重要的保護(hù)和修復(fù)作用。補(bǔ)骨脂酚是補(bǔ)骨脂的主要有效成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明補(bǔ)骨脂酚具有良好的促進(jìn)骨骼再生與重建的作用[26]。分子對(duì)接結(jié)果驗(yàn)證了骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂中核心活性成分與AKT1、TP53、IL-6結(jié)合后均展現(xiàn)出良好的親和力，其結(jié)合能越低代表受體與配體的親和力越好，一般認(rèn)為結(jié)合能小于-4.25 kcal/mol 提示配體與受體有一定的結(jié)合活性，小于-5.0 kcal/mol有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 kcal/mol有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[27]，說(shuō)明骨碎補(bǔ)和補(bǔ)骨脂的活性成分與核心靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合性。因此，本研究從一定程度上揭示了骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP的主要活性成分，為其治療BCP提供了一定的依據(jù)。

從拓?fù)涑龅年P(guān)鍵節(jié)點(diǎn)來(lái)看，AKT1、TP53、IL-6、MAPK1、EGFR、VEGFA、ESR1、MAPK14、JUN、TNF等靶點(diǎn)蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，既是骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂的藥物作用靶點(diǎn)，又是BCP的疾病靶點(diǎn)，提示這些靶點(diǎn)可能是骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂作用于BCP的直接作用靶點(diǎn)。結(jié)合GO分析及KEGG分析結(jié)果，骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP的可能作用機(jī)制與以下四個(gè)方面有關(guān)：（1）BCP的主要病理是骨組織的破壞，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的增殖與分化參與骨發(fā)育和骨代謝的生物學(xué)過(guò)程[28]，從KEGG通路結(jié)果可知富集基因數(shù)最多的通路是癌癥通路，其中癌癥相關(guān)通路包括經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，該通路對(duì)調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡起著重要的作用[29-30];骨碎補(bǔ)與補(bǔ)骨脂為臨床補(bǔ)腎強(qiáng)骨要藥，文獻(xiàn)[31-32]表明骨碎補(bǔ)與補(bǔ)骨脂可通過(guò)多種代謝途徑保護(hù)骨組織，不僅可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨性分化及成骨細(xì)胞的增殖，還能抑制破骨細(xì)胞的的骨吸收。因此，骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP可能通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡從而起到保護(hù)和修復(fù)骨的作用。（2）近年來(lái)，研究[33]發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞與BCP的產(chǎn)生具有緊密的聯(lián)系，當(dāng)各種傷害性刺激引起外周敏化時(shí)，初級(jí)傳入神經(jīng)末梢釋放P物質(zhì)，特異性與小膠質(zhì)細(xì)胞受體結(jié)合，小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生肥大，并可以釋放大量的促炎性因子，參與并維持BCP的發(fā)生。從PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)可知，TNF與IL-6作為促炎細(xì)胞因子在BCP的發(fā)生和維持中起關(guān)鍵作用[34]。侯公瑾等[35]人通過(guò)建立BCP大鼠模型，發(fā)現(xiàn)蟾龍鎮(zhèn)痛膏可降低血清中TNF-α、IL-6，表明蟾龍鎮(zhèn)痛膏對(duì)BCP大鼠有鎮(zhèn)痛作用，其機(jī)制可能與抑制炎性因子釋放有關(guān)。另外MAPK被證實(shí)與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化相關(guān)，核心靶點(diǎn)中MAPK1與MAPK14均屬于MAPK，抑制MAPK信號(hào)通路可以顯著降低炎癥反應(yīng)[36]。因此，骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂可能通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化衍生的促炎細(xì)胞因子和激活相關(guān)信號(hào)通路，有效緩解BCP。（3）神經(jīng)病理性性疼痛是BCP的病理機(jī)制之一，從結(jié)果可知多個(gè)靶點(diǎn)和通路直接或間接參與神經(jīng)病理性疼痛。研究[37-38]表明cAMP-PKA信號(hào)通路通過(guò)介導(dǎo)炎癥介質(zhì)引起的外周痛覺(jué)敏化和神經(jīng)病理性疼痛在大鼠BCP的產(chǎn)生和發(fā)展中起著重要的作用。此外，鈣的水平及其通道活動(dòng)有助于疼痛的神經(jīng)病理過(guò)程，因此，鈣信號(hào)通路的激活在BCP中有重要的作用[39]。HIF-1α是低氧適應(yīng)性反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α通過(guò)上調(diào)SDF1-CXCR4信號(hào)進(jìn)而參與神經(jīng)性病理性疼痛的發(fā)生與維持[40]。因此，骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂可能通過(guò)抑制異常的神經(jīng)元反應(yīng)從而達(dá)到緩解BCP的目的。（4）BCP的主要病因是腫瘤自身引起，因此，抗腫瘤也是治療BCP的主要治療方法之一，骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP的核心靶點(diǎn)和通路中包括多個(gè)腫瘤相關(guān)的靶基因，其作用機(jī)制可能是通過(guò)作用于腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)直接或間接起到抗BCP的作用。一項(xiàng)VEGF家族在癌性疼痛中的外周感官神經(jīng)元的功能作用的研究[41]表明BCP受腫瘤細(xì)胞-血管和神經(jīng)之間的相互作用調(diào)節(jié)。EGFR在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，相關(guān)研究[42]表明EGFR參與并維持神經(jīng)病變及炎癥性疼痛，在多種疼痛動(dòng)物模型中抑制EGFR可起到鎮(zhèn)痛作用。JUN基因?qū)儆谠┗蛑?，有研究[43]表明JUN是緩解神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵上調(diào)基因之一。PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為重要的抗腫瘤通路之一，研究[44-45]表明該通路可通過(guò)中樞敏化參與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠BCP脊髓水平的調(diào)節(jié)，在大鼠BCP發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接等手段，從直觀的角度對(duì)藥對(duì)骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂治療BCP進(jìn)行了整體的認(rèn)識(shí)，并說(shuō)明骨碎補(bǔ)-補(bǔ)骨脂可通過(guò)直接或間接靶點(diǎn)介導(dǎo)的多個(gè)主流信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)多靶點(diǎn)、多層次作用于BCP，為進(jìn)一步深入研中藥干預(yù)BCP提供了重要參考，相比于傳統(tǒng)藥理學(xué)研究呈現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢(shì)。受限于本研究?jī)H單純的考慮到中藥、活性化合物、靶點(diǎn)三者之間的數(shù)量關(guān)系，尚未兼顧到活性化合物與靶點(diǎn)產(chǎn)生的藥效強(qiáng)度因素，因此，藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制還需要通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 賴桂花，袁? 晶，閆鈺婷，等.骨轉(zhuǎn)移癌痛的中西醫(yī)治療進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（9）：1166-1170.

[2] KIM M H， OH J E， PARK S， et al. Tramadol use is associated with enhanced postoperative outcomes in breast cancer patients： A retrospective clinical study with in vitro confirmation[J]. British Journal of Anaesthesia， 2019， 123（6）： 865-876.

[3] 閆曉倩，趙君慧，王淼舟.癌痛規(guī)范化診治的研究現(xiàn)狀及影響因素分析[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2015，17（10）：104-106.

[4] DERRY S， WIFFEN P J， MOORE R A， et al. Oral nonsteroidal anti-inflammatory drugs （NSAIDs） for cancer pain in adults[J]. The Cochrane Database of Systematic Reviews， 2017， 7： CD012638.

[5] YANG B， ZHANG Z， YANG Z， et al. Chanling Gao attenuates bone cancer pain in rats by the IKKβ/NF-κB signaling pathway[J]. Frontiers in Pharmacology， 2020， 11： 525.

[6] 劉? 丹，焦良波，陳? 濤，等.基于對(duì)骨癌痛大鼠脊髓TAK1/JNK/c-Jun信號(hào)通路的調(diào)控探討華蟾素鎮(zhèn)痛機(jī)制[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2021，56（2）：108-114.

[7] 焦良波，劉? 丹，陳? 濤，等.華蟾素對(duì)骨癌痛大鼠鎮(zhèn)痛機(jī)制探討[J].中草藥，2020，51（14）：3734-3741.

[8] 賴桂花，向婷婷，王? 菲，等.基于數(shù)據(jù)挖掘?qū)χ嗅t(yī)內(nèi)服方劑治療骨轉(zhuǎn)移癌痛證治規(guī)律的分析[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，41（4）： 586-592.

[9] 姚? 暄，賈立群，譚煌英，等.補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型骨痛及骨質(zhì)破壞的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012，40（2）：14-16.

[10] 蔡? 浩.單味骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂及雙味聯(lián)合防治去勢(shì)大鼠骨丟失的實(shí)驗(yàn)研究[D].合肥： 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[11] MA C， WANG X， XU T， et al. An integrative pharmacology-based analysis of refined qingkailing injection against cerebral ischemic stroke： A novel combination of baicalin， geniposide， cholic acid， and hyodeoxycholic acid[J]. Frontiers in Pharmacology， 2020， 11： 519.

[12] HUANG S Q， ZHANG Z Y， LI W Q， et al. Network pharmacology-based prediction and verification of the active ingredients and potential targets of zuojinwan for treating colorectal cancer[J]. Drug Design， Development and Therapy， 2020， 14： 2725-2740.

[13] SHEN M Y， TIAN S， LI Y Y， et al. Drug-likeness analysis of traditional Chinese medicines： 1. property distributions of drug-like compounds， non-drug-like compounds and natural compounds from traditional Chinese medicines[J]. Journal of Cheminformatics， 2012， 4（1）： 1-13.

[14] DONCHEVA N T， MORRIS J H， GORODKIN J， et al. Cytoscape StringApp： Network analysis and visualization of proteomics data[J]. Journal of Proteome Research， 2019， 18（2）： 623-632.

[15] HUANG D W， SHERMAN B T， TAN Q N， et al. DAVID Bioinformatics Resources： Expanded annotation database and novel algorithms to better extract biology from large gene lists[J]. Nucleic Acids Research， 2007， 35（suppl_2）： W169-W175.

[16] GAILLARD T. Evaluation of AutoDock and AutoDock vina on the CASF-2013 benchmark[J]. Journal of Chemical Information and Modeling， 2018， 58（8）： 1697-1706.

[17] 于大鵬，孫衛(wèi)強(qiáng).骨碎補(bǔ)及其提取物應(yīng)用于骨科疾病的藥理作用研究概況[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2021，14（4）：761-766.

[18] 魯亞奇，張? 曉，王金金，等.補(bǔ)骨脂化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（3）：180-189.

[19] BAEK Y， LEE M N， WU D， et al. Luteolin reduces adipose tissue macrophage inflammation and insulin resistance in postmenopausal obese mice[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry， 2019， 71： 72-81.

[20] 劉? 楊，呂冰清，吳玉梅，等.木犀草素抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠NLRP3炎性小體活化增強(qiáng)關(guān)節(jié)骨保護(hù)作用研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2021，36（1）：513-516.

[21] 崔琳娜，蔣校文，黃華慶，等.山奈酚通過(guò)mTORC1信號(hào)促進(jìn)牽張力下小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化機(jī)制研究[J].口腔疾病防治，2021，29（4）：234-240.

[22] 程杏安，周曉武，張淑明，等.植物甾醇對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及凋亡誘導(dǎo)作用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（10）：94-97，4.

[23] WALKER C I B， OLIVEIRA S M， TONELLO R， et al. Anti-nociceptive effect of stigmasterol in mouse models of acute and chronic pain[J]. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology， 2017， 390（11）： 1163-1172.

[24] 李洪波，魏云鵬，楊? 芳，等. 補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2020，26（1）：18-21，26.

[25] 李勁平，謝保平，章文娟，等.補(bǔ)骨脂素通過(guò)調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化抑制RAW264.7向破骨細(xì)胞分化和骨吸收[J].中國(guó)中藥雜志，2018，

43（6）：1228-1234.

[26] 楊勝杰，鐘少達(dá)，楊進(jìn)平，等.補(bǔ)骨脂酚的提取純化工藝優(yōu)選及其對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（22）：43-47.

[27] ISTYASTONO E P， RADIFAR M， YUNIARTI N， et al. PyPLIF HIPPOS： A molecular interaction fingerprinting tool for docking results of AutoDock vina and PLANTS[J]. Journal of Chemical Information and Modeling， 2020， 60（8）： 3697-3702.

[28] ZAJ?CZKOWSKA R， KOCOT-K?PSKA M， LEPPERT W， et al. Bone pain in cancer patients： Mechanisms and current treatment[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（23）： 6047.

[29] CHEN Y， ALMAN B A. Wnt pathway， an essential role in bone regeneration[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2009， 106（3）： 353-362.

[30] ALBERS J， KELLER J， BARANOWSKY A， et al. Canonical Wnt signaling inhibits osteoclastogenesis independent of osteoprotegerin[J]. The Journal of Cell Biology， 2013， 200（4）： 537-549.

[31] SHEN Z， CHEN Z H， LI Z G， et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae enhances angiogenic-osteogenic coupling during

distraction osteogenesis by promoting type H vessel formation through PDGF-BB/PDGFR-β instead of HIF-1α / VEGF axis[J]. Frontiers in Pharmacology， 2020， 11： 503524.

[32] 李嘯群，徐凱航，紀(jì)? 方.補(bǔ)骨脂異黃酮抑制破骨細(xì)胞分化緩解小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松[J].中國(guó)組織工程研究，2021，25（2）：186-190.

[33] DEMIR I E， TIEFTRUNK E， SCHORN S， et al. Activated Schwann cells in pancreatic cancer are linked to analgesia via suppression of spinal astroglia and microglia[J]. Gut， 2016， 65（6）： 1001-1014.

[34] 李秋月，許海玉，楊洪軍.促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-6在神經(jīng)病理性疼痛中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2017，42（19）：3709-3712.

[35] 侯公瑾，柏正平，曾普華，等.蟾龍鎮(zhèn)痛膏對(duì)骨轉(zhuǎn)移性癌痛模型大鼠疼痛閾值及血清PGE2、TNF-α、IL-6、β-EP的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2019，30（10）：1222-1227.

[36] HU X M， LIU Y N， ZHANG H L， et al. CXCL12/CXCR4 chemokine signaling in spinal Glia induces pain hypersensitivity through MAPKs-mediated neuroinflammation in bone cancer rats[J]. Journal of Neurochemistry， 2015， 132（4）： 452-463.

[37] DUTRA R C， BICCA M A， SEGAT G C， et al. The antinociceptive effects of the tetracyclic triterpene euphol in inflammatory and neuropathic pain models： The potential role of PKCε[J]. Neuroscience， 2015， 303： 126-137.

[38] 賀端端，郭向陽(yáng).cAMP-PKA信號(hào)通路介導(dǎo)大鼠骨癌痛的產(chǎn)生和維持[J].中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2015，21（1）：10-14.

[39] BOURINET E， ALTIER C， HILDEBRAND M E， et al. Calcium-permeable ion channels in pain signaling[J]. Physiological Reviews， 2014， 94（1）： 81-140.

[40] YANG F， LUO W J， SUN W， et al. SDF1-CXCR4 signaling

maintains central post-stroke pain through mediation of glial-neur?

onal interactions[J]. Frontiers in Molecular Neuroscience， 2017， 10： 226.

[41] SELVARAJ D， GANGADHARAN V， MICHALSKI C W， et al. A functional role for VEGFR1 expressed in peripheral sensory neurons in cancer pain[J]. Cancer Cell， 2015， 27（6）： 780-796.

[42] WANG S， LIU S Y， XU L P， et al. The upregulation of EGFR in the dorsal root ganglion contributes to chronic compression of dorsal root ganglions-induced neuropathic pain in rats[J]. Molecular Pain， 2019， 15： 174480691985729.

[43] YAN X T， XU Y， CHENG X L， et al. SP1， MYC， CTNNB1， CREB1， JUN genes as potential therapy targets for neuropathic pain of brain[J]. Journal of Cellular Physiology， 2019， 234（5）： 6688-6695.

[44] JIN D， YANG J P， HU J H， et al. MCP-1 stimulates spinal

microglia via PI3K/Akt pathway in bone cancer pain[J]. Brain Research， 2015， 1599： 158-167.

[45] 袁翠堂，丁? 罡，廖志軍，等.大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型中PI3K/Akt信號(hào)通路參與誘導(dǎo)疼痛[J].實(shí)用癌癥雜志，2016，31（3）：349-352，358.