程博 范婧瑩 劉潔 蘇芮 周芳亮 黃若茹 王賢文 何迎春

〔摘要〕 目的 運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證茯苓抗鼻咽癌的物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在機(jī)制。方法 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)檢索茯苓的化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)。通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)查詢靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因，使用STRING構(gòu)建共同靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）;進(jìn)而運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建茯苓活性成分-鼻咽癌-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖，通過(guò)R軟件編程進(jìn)行GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析，最后采用MTT和Western blot法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 茯苓活性成分-鼻咽癌-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含8個(gè)活性成分，18個(gè)共同靶點(diǎn)，主要富集到4條通路。茯苓的主要抗鼻咽癌活性成分有茯苓酸、茯苓新酸B、常春藤皂甙等，出現(xiàn)頻次較高的靶點(diǎn)有TP53、INS、ESR1、PTGS2等，這些靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞因子活性、免疫炎癥系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物過(guò)程，且靶點(diǎn)主要富集在甲狀腺激素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、PI3K/AKT等信號(hào)通路。MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，茯苓酸組（2.5、5.0、10 μmol·L-1）對(duì)CNE2細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用（P<0.05或P<0.01）。Western blot結(jié)果顯示，藥物處理24 h后，與對(duì)照組比， 茯苓酸組（5.0 μmol·L-1）降低了CNE2細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PI3K、p-AKT的表達(dá)水平（P<0.05或P<0.01），對(duì)AKT的表達(dá)無(wú)明顯差異性（P>0.05）。結(jié)論 茯苓可通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)和多通路影響鼻咽癌細(xì)胞的增殖。且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，茯苓抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);茯苓;鼻咽癌;分子機(jī)制

〔中圖分類號(hào)〕R273? ? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.012

Network Pharmacology Analysis and Verification of the Material Basis and Potential

Mechanism of Fuling （Poria） Against Nasopharyngeal Carcinoma

CHENG Bo1，2， FAN Jingying1，2， LIU Jie1， SU Rui1， ZHOU Fangliang1，3， HUANG Ruoru1， WANG Xianwen2，4， HE Yingchun1，2，3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Ophthalmology and Otolaryngology Diseases Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine and Visual Function Protection Engineering and Technological Research Center， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 4. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To verify the material basis and potential mechanism of Fuling （Poria） against nasopharyngeal carcinoma by network pharmacology prediction and experiment. Methods The chemical constituents and targets of Fuling （Poria） were searched by traditional Chinese medicine system pharmacology （TCMSP） database and BATMAN-TCM database. UniProt database was used to query the genes corresponding to the target， and STRING was used to construct the common target interaction network （PPI）. The PPI of Fuling （Poria） active ingredient-nasopharyngal carcinoma-target was constructed by using Cytoscape 3.7.2 software. GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were carried out by R software programming. Finally， MTT and Western blot were used to verify the results. Results Fuling （Poria） active component-nasopharyngeal carcinoma-target network contained 8 active components and 18 common targets， mainly enriched into 4 pathways. The main anti nasopharyngeal carcinoma active components Fuling （Poria） were pachymenic acid， pachymenic acid B， ivy saponins， etc. The high frequency targets were TP53， INS， ESR1， PTGS2， etc. These targets were mainly related to cytokine activity， immune inflammatory system， tumor angiogenesis， tumor cell proliferation， apoptosis， migration， etc. These targets were mainly enriched in thyroid hormone signaling pathway， estrogen signaling pathway， PI3K/AKT signaling pathway， etc. MTT results showed that compared with the control group， the proliferation of CNE2 cells was significantly inhibited in Fuling （Poria） groups （2.5， 5.0， 10 μmol·L-1） （P<0.05 or P<0.01）. Western blot results showed that compared with control group， Fuling （Poria） group （5.0 μmol·L-1） decreased the expression levels of PI3K and p-AKT， the key proteins of PI3K/AKT signaling pathway in CNE2 cells after treated for 24 hours （P<0.05 or P<0.01）， but there was no significant difference in the expression of AKT（P>0.05）. Conclusion Fuling （Poria） can affect the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells through multiple components， multiple targets and multiple pathways. It was confirmed that the inhibitory effect of Fuling （Poria） on nasopharyngeal carcinoma cells proliferation was related to the inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.

〔Keywords〕 network pharmacology; Fuling （Poria）; nasopharyngeal carcinoma; molecular mechanism

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是臨床常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，其惡性程度高，70%的患者被確診時(shí)已為晚期[1-2]。以放療和化療相結(jié)合的綜合治療是目前治療NPC的主要方法，但復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是治療失敗的主要原因[3]。目前，中醫(yī)藥抗腫瘤藥物日益受到關(guān)注，因其與化療藥物相比，在抑殺腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[4]。

中藥茯苓Poria cocos （Schw.） Wolf.屬多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核[5]，其主要分布在我國(guó)安徽、福建、河南、四川、云南、貴州、湖北和廣東、廣西等地[6]。茯苓載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性味甘、淡、平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有健脾寧心、利水滲濕等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[7]發(fā)現(xiàn)，茯苓的主要化學(xué)成分為三萜類和多糖類，具有抗炎、抗腫瘤、利尿、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)茯苓酸能抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，并能降低增殖相關(guān)蛋白生存素、X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白、增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)水平[8]，但茯苓抗NPC的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制尚不清楚。

因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建了茯苓的活性成分、NPC與藥物靶點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為揭示茯苓抗NPC的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1? 茯苓活性成分的篩選

應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索茯苓的所有活性成分。根據(jù)研究結(jié)果，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為限制條件進(jìn)行篩選，得到茯苓的生物活性成分。

1.2? 活性成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)檢索茯苓所有活性成分的靶基因，并應(yīng)用Perl語(yǔ)言程序結(jié)合UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）對(duì)茯苓活性成分的靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，獲得標(biāo)準(zhǔn)化的靶點(diǎn)。通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件（https：//cytoscape.org/）構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，以探究茯苓的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1.3? 鼻咽癌的疾病靶點(diǎn)篩選

以“nasopharynx cancer”為檢索關(guān)鍵詞，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）及OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org/）檢索NPC的疾病靶點(diǎn)，并將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出來(lái)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行合并。

1.4? 活性成分與疾病的共同靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

篩選NPC的疾病靶點(diǎn)與茯苓活性成分的靶點(diǎn)之間的共同靶點(diǎn)，應(yīng)用R軟件（https：//www.r-project.org/）編程進(jìn)行篩選，并繪制韋恩圖。應(yīng)用STRING（https：//string-db.org/）插件構(gòu)建共同靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction， PPI），參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5? 活性成分-鼻咽癌-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建活性成分-NPC-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，查閱文獻(xiàn)，基于構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)探討茯苓對(duì)鼻咽癌療效的潛在分子機(jī)制。

1.6? Gene Ontology（GO）生物功能分析和KEGG Pathway富集

應(yīng)用R軟件（https：//www.r-project.org/）編程獲得NPC與茯苓活性成分的共同靶點(diǎn)的entrez ID，接著對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG Pathway富集分析，GO分析主要用于描述基因產(chǎn)物的功能，KEGG Pathway富集分析主要用于分析核心通路富集程度，進(jìn)一步探索茯苓抗NPC可能的生物功能及信號(hào)通路機(jī)制。

1.7? 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

人鼻咽癌CNE2細(xì)胞購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。茯苓酸購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司;順鉑（Cisplatin），齊魯制藥有限公司（貨號(hào)：H20023460）。采用不同濃度（0、2.5、5.0、10、20 μmol·L-1）的茯苓酸、陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑（Cisplatin，4 mg·L-1）處理鼻咽癌細(xì)胞24、48、36 h，使用MTT法檢測(cè)處理后細(xì)胞的增殖情況。用不同濃度（0、2.5、5.0 μmol·L-1）的茯苓酸干預(yù)細(xì)胞24 h，采用Western blot法檢測(cè)茯苓酸對(duì)鼻咽癌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。具體方法參考文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以“x±s”表示。單因素設(shè)計(jì)和多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，多重比較則采用LSD法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果分析圖由GraphPad Prism 8.0軟件制作完成。 2 結(jié)果

2.1? 茯苓活性成分篩選

通過(guò)TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)茯苓的活性成分進(jìn)行檢索，并以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為限制條件進(jìn)行篩選，去掉重復(fù)成分后共得到17個(gè)生物活性成分。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2? 活性成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)上述數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，由Cytoscape 3.7.1軟件可獲得與茯苓相關(guān)的活性成分的作用靶點(diǎn)共70個(gè)（不含重復(fù)），構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)。其中排名前3的是：MOL000291（poricoic acid B，茯苓新酸B），其degree為29;MOL000289（pachymic acid，茯苓酸），其degree為23;MOL000296（hederagenin，常春藤皂甙元），其degree為16。見(jiàn)圖1。

2.3? 鼻咽癌的疾病靶點(diǎn)篩選

通過(guò)檢索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)得到NPC的疾病治療靶點(diǎn)，不設(shè)置Relevance score，并刪去重復(fù)靶點(diǎn)，共得到1 968個(gè)NPC的疾病治療靶點(diǎn)。

2.4? 共同靶點(diǎn)篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1 968個(gè)NPC的疾病治療靶點(diǎn)與70個(gè)藥物活性成分作用靶點(diǎn)應(yīng)用R軟件編程篩選出共同靶點(diǎn)并畫(huà)出韋恩圖，得到共同靶點(diǎn)為18個(gè)，得到的韋恩圖見(jiàn)圖2;應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)輸入18個(gè)共同靶點(diǎn)，默認(rèn)設(shè)置下構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），見(jiàn)圖3。應(yīng)用R軟件編程統(tǒng)計(jì)各靶點(diǎn)出現(xiàn)頻次，出現(xiàn)頻次較高的有TP53、INS、ESR1、PTGS2等，可作為茯苓治療NPC的潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4。

2.5? 活性成分-鼻咽癌-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.1軟件在活性成分-NPC-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖中，共獲得28個(gè)節(jié)點(diǎn)（靶點(diǎn)18個(gè)，活性成分8個(gè)，疾病和藥物各1個(gè)），見(jiàn)圖5。在圖中我們可以看出排名前3的活性成分為pachymic acid（茯苓酸）、hederagenin（常春藤皂甙元）、poricoic acid B（茯苓新酸B） 。

2.6? 茯苓治療鼻咽癌的生物功能（GO）分析及核心通路篩選

并利用R軟件編程對(duì)以上共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析得到的柱狀圖見(jiàn)圖6，其靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞因子活性、免疫炎癥系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物過(guò)程。這體現(xiàn)了茯苓可能通過(guò)調(diào)控多個(gè)生物過(guò)程來(lái)治療NPC。圖7顯示了茯苓作用靶點(diǎn)的KEGG Pathway富集分析結(jié)果，表2中列出了富集靶點(diǎn)數(shù)目≥4的信號(hào)通路，這表示茯苓主要通過(guò)作用于4條信號(hào)通路來(lái)治療NPC。

2.7? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7.1? MTT檢測(cè)茯苓酸對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度茯苓酸組（2.5、5.0、10 μmol·L-1）和順鉑4 mg·L-1組分別作用 CNE2細(xì)胞24、36、48 h后，對(duì)CNE2細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。見(jiàn)圖8。

2.7.2? Western blot法檢測(cè)茯苓酸對(duì)鼻咽癌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響? 藥物處理24 h后，與對(duì)照組比，茯苓酸5.0 mol·mL-1組降低了PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PI3K、p-AKT的表達(dá)水平（P<0.05或P<0.01），對(duì)AKT的表達(dá)無(wú)明顯差異性（P>0.05）。見(jiàn)圖9。

3 討論

NPC是一種上皮源性惡性腫瘤，是我國(guó)南方各省常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，目前其主要治療方法為放化療[11]。茯苓以三萜類和多糖類為主要化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[7]，其具有抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，從分子和整體水平進(jìn)行中藥的系統(tǒng)分析，獲得中藥的核心化學(xué)成分-蛋白靶標(biāo)，明確中藥的作用機(jī)制，為中藥研究提供新的思路[12]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，共獲得茯苓17個(gè)生物活性成分，通過(guò)構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，得到與茯苓相關(guān)的活性成分的作用靶點(diǎn)共70個(gè)，并獲得茯苓酸、茯苓新酸B和常春藤皂甙元等關(guān)鍵活性成分。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)：茯苓酸可通過(guò)抑制線粒體途徑來(lái)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[13]，且茯苓酸也可誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞T24凋亡[14]。

對(duì)茯苓與鼻咽癌的共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI映射，并構(gòu)建茯苓活性成分-NPC-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)頻次較高的靶點(diǎn)有TP53、INS、ESR1、PTGS2等，這些靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞因子活性、免疫炎癥系統(tǒng)、腫瘤新生血管形成和腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等，這些生物過(guò)程在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，鼻咽癌組織內(nèi)存在TP53基因突變[15-16]，其可通過(guò)調(diào)控Bcl-2和Bax的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老或凋亡[17]。PTGS2即為環(huán)氧合酶COX-2的別稱，研究發(fā)現(xiàn)沉默COX-2的表達(dá)，可阻滯細(xì)胞周期，抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力[18]。KEGG通路富集分析顯示靶點(diǎn)主要富集在甲狀腺激素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、PI3K/AKT等信號(hào)通路。研究證實(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路在鼻咽癌、胃癌和肝癌等多種癌癥發(fā)揮關(guān)鍵作用，該通路參與血管生成和細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等調(diào)節(jié)[19]。

最后，本研究團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茯苓酸能明顯抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖（P<0.05或P<0.01），且明顯降低了PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PI3K、p-AKT的表達(dá)水平（P<0.05或P<0.01），提示茯苓酸可能是通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)。綜上所述，本研究系統(tǒng)預(yù)測(cè)了茯苓抗NPC的作用機(jī)制，證實(shí)茯苓酸是茯苓抗NPC的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，PI3K/AKT信號(hào)通路是其發(fā)揮抗NPC作用的重要機(jī)制之一，為茯苓臨床干預(yù)NPC提供了一定的理論依據(jù)。

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