劉 博,楊 焜,魏曉慧,蔡軍杰,李 釩,田 豐
(軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院衛(wèi)勤保障技術(shù)研究所,天津 300161)
碳點(diǎn)(carbon dots,CDs)是碳材料中一種新型的納米功能材料。2004年,Xu等[1]采用凝膠電泳分離純化電弧放電法制備單壁碳納米管,首次發(fā)現(xiàn)了一種具有熒光性能的碳納米顆粒。2006年,Sun等[2]利用激光蝕刻技術(shù)刻蝕碳靶制得熒光碳納米顆粒,并首次命名為碳點(diǎn)。碳點(diǎn)具有優(yōu)良的光學(xué)性能[3]、穩(wěn)定的熒光性質(zhì)[4]、良好的生物相容性[5]等特點(diǎn)[6-7]。
水熱法是將有機(jī)或無(wú)機(jī)碳源和水或有機(jī)溶劑混合后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜,通過(guò)加熱使反應(yīng)釜內(nèi)產(chǎn)生高溫高壓制備碳點(diǎn)的一種方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是一步即可將碳源碳化生成高熒光量子產(chǎn)率且在表面帶有功能化基團(tuán)的碳點(diǎn),相較微波法[8]、電化學(xué)氧化法[9]等制備方法,水熱法制備工藝較為簡(jiǎn)便,且制備出的碳點(diǎn)粒徑較為均勻[10]。
在檢測(cè)領(lǐng)域,碳點(diǎn)主要應(yīng)用在金屬離子、有機(jī)小分子、有機(jī)大分子、微生物等方面。目前,在金屬離子、有機(jī)小分子、有機(jī)大分子檢測(cè)領(lǐng)域,碳點(diǎn)被用作傳感器的熒光檢測(cè)主要有3種檢測(cè)策略,即熒光關(guān)閉、熒光開(kāi)啟和熒光比率[11]。在熒光關(guān)閉檢測(cè)策略中,溶液的變化會(huì)影響熒光信號(hào),導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確;對(duì)于熒光開(kāi)啟檢測(cè)策略,熒光開(kāi)啟的程度與分析物的濃度有關(guān),熒光強(qiáng)度增加更易得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果;在熒光比率策略中,參考信號(hào)可以消除溶液變化引起的誤差,其精度優(yōu)于熒光開(kāi)啟策略。碳點(diǎn)傳感器的有效性通常用檢測(cè)限(limit of detection,LOD)、傳感器的線性范圍和淬滅比等參數(shù)表示。LOD是指可靠檢測(cè)和測(cè)量的最低分析物濃度;傳感器的線性范圍表示碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與分析物濃度范圍的線性關(guān)系;淬滅比表示分析物淬滅碳點(diǎn)的能力,當(dāng)淬滅比達(dá)到0時(shí),碳點(diǎn)完全失去了光致發(fā)光性能[11-12]。碳點(diǎn)用于細(xì)菌的檢測(cè)方法與金屬離子、有機(jī)小分子、有機(jī)大分子的檢測(cè)方法不同。在細(xì)菌的檢測(cè)領(lǐng)域,首先利用碳點(diǎn)的熒光特性標(biāo)記細(xì)菌,然后根據(jù)熒光強(qiáng)度與細(xì)菌數(shù)量的線性關(guān)系,最終計(jì)算出細(xì)菌的數(shù)量,達(dá)到檢測(cè)的目的[13]。本文首先介紹水熱法制備碳點(diǎn),著重對(duì)碳點(diǎn)在檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述,并對(duì)水熱法制備的碳點(diǎn)如何更好地應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域進(jìn)行展望。
Xu等[14]利用酒石酸和麩皮為雙碳源,以二甲基甲酰胺為溶劑,在高壓反應(yīng)釜150℃下熱處理8 h,制備出光致發(fā)光量子產(chǎn)率高達(dá)46%、粒徑主要集中在4~6 nm、平均粒徑為4.85 nm的綠色熒光發(fā)射碳點(diǎn)(如圖1所示)。該碳點(diǎn)具有優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性和良好的熒光性能,且生物相容性好、細(xì)胞毒性低。以石墨烯量子點(diǎn)為研究對(duì)象,Zhang等[15]建立了一種簡(jiǎn)單的一鍋法制備碳點(diǎn)。以二甲基甲酰胺作為氮的來(lái)源與溶劑,制備的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)在紫外燈照射(365 nm)下呈亮綠色發(fā)射。這種石墨烯量子點(diǎn)靈敏度高、重現(xiàn)性好、粒徑均一、長(zhǎng)期穩(wěn)定性好。
圖1 以酒石酸和麩皮為雙碳源制備的綠色熒光發(fā)射碳點(diǎn)[14]
為合成簡(jiǎn)單廉價(jià)的碳點(diǎn),Khaledian等[16]利用番茄汁為反應(yīng)物,以無(wú)水乙醇為溶劑,在高溫高壓反應(yīng)釜內(nèi)220℃條件下反應(yīng)2 h,所制備的碳點(diǎn)在485 nm有較強(qiáng)的熒光發(fā)射,其粒徑小于30 nm,熒光量子產(chǎn)率為38%。通過(guò)該方法制備的碳點(diǎn)生物相容性好、綠色無(wú)毒,對(duì)有機(jī)磷毒物如二嗪農(nóng)有較高靈敏度,因此可在該類物質(zhì)的檢測(cè)中較好應(yīng)用。Yang等[17]采用同樣的方法將檸檬酸和尿素溶于無(wú)水乙醇中,在高溫高壓反應(yīng)釜內(nèi)180℃條件下反應(yīng)7 h,制得粒徑在26 nm左右、熒光量子產(chǎn)率為9.47%的氮摻雜碳點(diǎn)。該碳點(diǎn)在pH 6~10的溶液中熒光強(qiáng)度變化不明顯,在pH 7.4下易被鄰苯二酚淬滅,表明基于該碳點(diǎn)的傳感系統(tǒng)可以快速、靈敏、選擇性地檢測(cè)鄰苯二酚。Xu等[18]以N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷為溶劑,以無(wú)水檸檬酸為反應(yīng)物,在240℃下反應(yīng)1 min,制得硅摻雜碳點(diǎn)(Si-CDs)。該碳點(diǎn)的粒徑在2 nm左右,熒光量子產(chǎn)率為14%,熒光壽命為2.349 ns。該研究在辣根過(guò)氧化物酶依賴熒光響應(yīng)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了一種新型的熒光傳感系統(tǒng),能有效地抑制Si-CDs在370 nm激發(fā)下470 nm處的熒光。這種方法不僅具有較好的靈敏度,而且避免了碳點(diǎn)與抗體之間復(fù)雜的生物結(jié)合步驟,大大地拓寬了該方法在食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。
碳點(diǎn)存在紅色發(fā)射區(qū)域的激發(fā)和發(fā)射不足、抗離子干擾與抗光漂白能力差、抗強(qiáng)酸強(qiáng)堿能力差、量子產(chǎn)率低等問(wèn)題,這嚴(yán)重限制了其在生物醫(yī)學(xué)分析和治療中的實(shí)際應(yīng)用[19-26]。Yang等[21]將2,5-二氨基苯磺酸溶于蒸餾水,利用水熱法在200℃高壓反應(yīng)釜中反應(yīng)10 h,制得粒徑3~7 nm的硫氮共摻雜紅色發(fā)射碳點(diǎn),在500 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)得碳點(diǎn)的絕對(duì)量子產(chǎn)率為2.67%。為進(jìn)一步增強(qiáng)碳點(diǎn)在紅色熒光區(qū)域的發(fā)射效應(yīng),Tao等[22]以聚丙烯酸和乙二胺為原料,利用反應(yīng)釜在200℃下水熱交聯(lián)8h,制備了一種絕對(duì)量子產(chǎn)率高達(dá)44.18%、粒徑分布在20~30 nm的新型聚合物碳點(diǎn)。通過(guò)交聯(lián)和包裹熒光中心來(lái)降低運(yùn)動(dòng)自由度和提供溶劑化效應(yīng),從而提高了量子產(chǎn)率,促使該碳點(diǎn)向紅色熒光發(fā)射區(qū)移動(dòng),這進(jìn)一步豐富了交聯(lián)增強(qiáng)發(fā)射效應(yīng)的解釋。
為解決碳點(diǎn)不耐金屬離子干擾的問(wèn)題,Zhang等[23]首次利用三磷酸腺苷,通過(guò)水熱法在180℃的反應(yīng)釜內(nèi)反應(yīng)10 h,制得平均粒徑為3.8 nm的水溶性磷氮共摻雜碳點(diǎn)。制備的磷氮共摻雜碳點(diǎn)在365 nm紫外燈照射下發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光,熒光量子產(chǎn)率為9.8%,其可以抗金屬離子、鹽溶液和高離子強(qiáng)度環(huán)境的干擾,具有較高的生物相容性和良好的成像性能,可以應(yīng)用于多功能復(fù)合材料體系中。
為提高碳點(diǎn)的抗光漂白、抗強(qiáng)酸強(qiáng)堿的能力,Liu等[24]以蛋氨酸和檸檬酸為原料,在200℃條件下的高溫高壓反應(yīng)釜中水熱反應(yīng)3 h,制備了氮硫摻雜的平均粒徑為5nm的藍(lán)色熒光發(fā)射碳點(diǎn)(如圖2所示),量子產(chǎn)率為13.8%,平均熒光壽命為3.67 ns。制備的碳點(diǎn)具有良好的熒光性能和抗光漂白性能,由于其表面上的羥基、羧基、氨基而具有很好的水溶性,抗強(qiáng)酸強(qiáng)堿能力強(qiáng)、離子強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好。
圖2 以蛋氨酸和檸檬酸為原料制備的藍(lán)色熒光發(fā)射碳點(diǎn)[24]
如何制備出高量子產(chǎn)率的碳點(diǎn)一直是研究者要解決的問(wèn)題。楊焜[25]以無(wú)水檸檬酸為碳源,將乙二胺作為表面鈍化劑,在200℃條件下通過(guò)一步水熱法制備藍(lán)色發(fā)射的碳點(diǎn)。該碳點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率高達(dá)79.7%,熒光性能優(yōu)異,生物相容性良好,可負(fù)載光敏劑用于腫瘤的光動(dòng)力治療。Hou等[26]對(duì)目前常用的檸檬酸-聚乙烯亞胺前體混合物的碳化工藝進(jìn)行了簡(jiǎn)單而有效的改進(jìn),在高壓反應(yīng)釜330℃條件下水熱處理6 h,制備了綠色發(fā)射的碳點(diǎn),其具有很強(qiáng)熒光性能,接近定量熒光量子產(chǎn)率的上限。
利用部分金屬離子對(duì)碳點(diǎn)熒光有淬滅作用的這一特性,Xu等[14]利用酒石酸和麩皮為雙碳源經(jīng)一鍋水熱法處理,制備出光致發(fā)光量子產(chǎn)率高達(dá)46%的綠色熒光發(fā)射碳點(diǎn)。利用Cu2+可淬滅該碳點(diǎn)熒光的作用,制備的綠色發(fā)射碳點(diǎn)可用于Cu2+檢測(cè)。該碳點(diǎn)對(duì)Cu2+有很好的選擇性和敏感性,證實(shí)了綠色熒光發(fā)射碳點(diǎn)對(duì)Cu2+的檢測(cè)具有很高的準(zhǔn)確性。Cu2+檢測(cè)范圍為0~0.5 mmol/L,LOD為0.050 7μmol/L。Fe3+是自然界重要的元素,也是人體必不可少的微量元素。Fe3+對(duì)碳點(diǎn)同樣具有淬滅作用,Rao等[27]以無(wú)水檸檬酸和乙二胺為前體,利用水熱法快速連續(xù)地大規(guī)模制備量子產(chǎn)率高達(dá)60.1%的碳點(diǎn)。該碳點(diǎn)可用于Fe3+的檢測(cè),其LOD為0.239μmol/L。為實(shí)現(xiàn)血清中Fe3+與L-半胱氨酸的共同檢測(cè),Yang等[21]以2,5-二氨基苯磺酸前體制備了硫氮共摻雜紅色發(fā)射碳點(diǎn),利用L-半胱氨酸與Fe3+的競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系,該碳點(diǎn)可以快速識(shí)別和定量分析Fe3+和L-半胱氨酸,其中Fe3+的檢測(cè)范圍為0~30μmol/L(LOD為0.27μmol/L),L-半胱氨酸的檢測(cè)范圍為0~24μmol/L(LOD為0.14μmol/L)。利用該碳點(diǎn)對(duì)人血清樣品中的Fe3+和L-半胱氨酸進(jìn)行了檢測(cè),得到的結(jié)果令人滿意。此外碳點(diǎn)還運(yùn)用在Cr6+[28]、Sn2+[29](如圖3所示)等金屬離子的檢測(cè)。
圖3 在開(kāi)—關(guān)—開(kāi)模式下測(cè)定Sn2+和L-賴氨酸的手性碳點(diǎn)探針的制備示意圖[29]
谷胱甘肽在代謝等方面發(fā)揮著重要作用[30-31]。Pan等[32]提出了一種基于控制碳點(diǎn)表面鈍化程度的新型谷胱甘肽熒光傳感器,制備的碳點(diǎn)對(duì)谷胱甘肽的檢測(cè)范圍為1.0~50.0μmol/L,LOD為0.943μmol/L?;谔键c(diǎn)的熒光傳感器可作為分析檢測(cè)生物環(huán)境、保健食品、藥品和化妝品中谷胱甘肽的有效工具。為提高對(duì)谷胱甘肽檢測(cè)的靈敏度與抗干擾能力,Song等[33]經(jīng)一步水熱法制備了具有pH依賴性和可變色熒光特性的多功能氮硫共摻雜碳點(diǎn),可以從半胱氨酸、同型半胱氨酸等其他硫醇中檢出谷胱甘肽,可作為高選擇性檢測(cè)谷胱甘肽的探針。該碳點(diǎn)在0~50μmol/L和50~100μmol/L范圍內(nèi)存在2個(gè)良好的線性關(guān)系,LOD為6.7μmol/L。炭疽桿菌有很高的致死率,因此對(duì)其進(jìn)行高效精準(zhǔn)的檢測(cè)至關(guān)重要?;诖耍琇i等[34]開(kāi)發(fā)了一種新型的、靈敏的無(wú)標(biāo)簽傳感器,用于檢測(cè)生物威脅劑炭疽的生物標(biāo)志物二苯胺酸,使用一個(gè)熒光“關(guān)—開(kāi)”碳點(diǎn)-銅(Ⅱ)系統(tǒng)。以多巴胺為前體,利用水熱法制備了量子產(chǎn)率為24.7%的熒光碳點(diǎn),銅(Ⅱ)使碳點(diǎn)熒光淬滅,而二苯胺酸與銅(Ⅱ)結(jié)合使得碳點(diǎn)熒光恢復(fù)。該碳點(diǎn)對(duì)二苯胺酸的檢測(cè)范圍為0.25~20μmol/L,LOD為0.079μmol/L。Mao等[35]制備了一種新型的、環(huán)保型分子印跡聚合物,并將其作為分子識(shí)別元件,構(gòu)建了多巴胺熒光傳感器。在有機(jī)硅烷中,通過(guò)水熱法制備了強(qiáng)熒光發(fā)射的碳點(diǎn),對(duì)多巴胺的檢測(cè)范圍為25~500 nmol/L,LOD為1.7 nmol/L。α-鵝膏毒素可使患者在短時(shí)間內(nèi)死于急性肝衰竭,基于此,F(xiàn)eng等[36]提出了一種利用水熱法制備的碳點(diǎn)嵌入特異性分子印跡聚合物用以直接檢測(cè)血清α-鵝膏毒素的新方法,碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與α-鵝膏毒素濃度在0.05~4.0μg/mL范圍內(nèi)存在線性關(guān)系,LOD為15 ng/mL。
碳點(diǎn)作為免疫傳感器已成為檢測(cè)抗原和疾病標(biāo)志物并用于癌癥診斷的重要手段[37]。He等[38]利用精氨酸和檸檬酸為前體通過(guò)水熱法制備碳點(diǎn),碳點(diǎn)作為標(biāo)記物成功地應(yīng)用于前列腺特異性抗原的檢測(cè),LOD為0.22 ng/mL。該碳點(diǎn)還可用于檢測(cè)癌胚抗原,LOD為0.56 ng/mL。此方法為構(gòu)建一個(gè)靈敏、通用的檢測(cè)平臺(tái)提供了一種有效的途徑。Zhang等[15]將二甲基甲酰胺作為溶劑和氮的來(lái)源,制備出氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)。利用紙基電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,以石墨烯量子點(diǎn)作為紙基電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、α-胎蛋白抗原作為模型蛋白,通過(guò)種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法制備了一種新型紙工作電極,可成為一種很有前景的抗體附著平臺(tái)(如圖4所示)。其對(duì)α-胎蛋白抗原線性檢測(cè)范圍為0.005~100 ng/mL,LOD為1.2 pg/mL。為實(shí)現(xiàn)對(duì)非傳染性疾病標(biāo)志物的測(cè)定,Othman等[39]提出了一種基于氮摻雜碳點(diǎn)的高選擇性、快速、環(huán)保的核基質(zhì)蛋白22(NMP22)熒光免疫分析技術(shù)。采用水熱法,以檸檬酸和尿素為原料,合成了高量子產(chǎn)率的氮摻雜碳點(diǎn)。單克隆抗體通過(guò)酰胺化技術(shù)標(biāo)記氮摻雜碳點(diǎn),在最佳條件下熒光強(qiáng)度與NMP22濃度在1.3~16.3 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,LOD為0.047 ng/mL。該方法可用于人體尿液中NMP22的測(cè)定,回收率為96.50%~103.61%。這些結(jié)果為非傳染性疾病作為免疫分析熒光標(biāo)記的潛在用途提供了可能。
圖4 基于種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法和紙基電化學(xué)發(fā)光免疫分析法的免疫傳感器制備工藝[15]
快速鑒別大腸桿菌[40-42]和金黃色葡萄球菌對(duì)保障人體健康至關(guān)重要。Zhao等[43]利用水熱法制備了一種基于pH敏感的碳點(diǎn),用于糖代謝觸發(fā)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鑒定。制備的碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度在pH 4.0~7.0的酸性范圍內(nèi)與溶液的酸堿度呈線性關(guān)系,利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在糖代謝能力方面存在的差異,該碳點(diǎn)可以產(chǎn)生可區(qū)分的熒光信號(hào),用于進(jìn)一步區(qū)分大腸桿菌和金黃色葡萄球菌(如圖5所示)。在葡萄糖存在下,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的LOD分別為21和33 cfu/mL,在乳糖存在下,大腸桿菌的LOD為762 cfu/mL。張春林等[44]以富含氨基的葡萄糖制備出氨基化碳點(diǎn),通過(guò)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺(EDC/NHS)化學(xué)偶聯(lián)法構(gòu)建碳點(diǎn)與大腸桿菌抗體的熒光探針,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157∶H7的快速檢測(cè)。為實(shí)現(xiàn)人體尿液中的鮑曼不動(dòng)桿菌的精準(zhǔn)檢測(cè),Bahari等[45]開(kāi)發(fā)出一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的新穎的比率型熒光適體傳感器,以鄰苯二胺碳點(diǎn)(o-CDs)、氮摻雜碳點(diǎn)為能量供體,氧化石墨烯為能量受體,用于鮑曼不動(dòng)桿菌的靈敏性和選擇性檢測(cè)。負(fù)載在氧化石墨烯邊緣的氮摻雜碳點(diǎn)表現(xiàn)出熒光淬滅,并且隨著修飾的o-CDs與核酸適配體(ssDNA)在氧化石墨烯表面吸附,o-CDs的熒光被有效淬滅。當(dāng)ssDNA與鮑曼不動(dòng)桿菌特異結(jié)合時(shí),釋放氧化石墨烯中的o-CDs-ssDNA,恢復(fù)o-CDs的熒光信號(hào),而氮摻雜碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化不大,其熒光強(qiáng)度在比值熒光分析中作為參考信號(hào)。熒光強(qiáng)度比(I550 nm/I440 nm)為2.0~10.0,細(xì)菌濃度為2.0×103~4.5×107cfu/mL,最低LOD為3.0×102cfu/mL。該方法證明了所研制的適體傳感器用于人體尿液中鮑曼不動(dòng)桿菌選擇性檢測(cè)的可行性。
圖5 碳點(diǎn)辨別并檢測(cè)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌原理圖[43]
綜上所述,通過(guò)水熱法制備的碳點(diǎn)具備優(yōu)異的熒光性能,已在金屬離子、有機(jī)小分子、有機(jī)大分子、微生物等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。但目前制備出的碳點(diǎn)大多數(shù)為藍(lán)色發(fā)射碳點(diǎn)且量子產(chǎn)率有待提高,因此期望通過(guò)改變分子前體或者摻雜氮、硫等元素,獲得多色發(fā)射碳點(diǎn)或者獲得熒光性能更強(qiáng)、熒光量子產(chǎn)率更高的碳點(diǎn)。而且碳點(diǎn)的抗酸堿能力弱,在強(qiáng)酸強(qiáng)堿的環(huán)境下碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度大大降低,后期希望開(kāi)發(fā)出耐酸堿的碳點(diǎn),使碳點(diǎn)可應(yīng)用于強(qiáng)酸強(qiáng)堿的環(huán)境。碳點(diǎn)在熒光檢測(cè)方面的應(yīng)用還處于起步階段,對(duì)物質(zhì)識(shí)別響應(yīng)的靈敏度和抗干擾能力需進(jìn)一步改善,檢測(cè)范圍有限而且使用范圍也需要拓展,而不是局限于少數(shù)幾種模型分子,后續(xù)可以嘗試構(gòu)建膜載體[46-47]、膠體體系[48]、核殼包覆[49]、加入摻雜物[50]增加碳點(diǎn)的熒光性能,或者利用微流控技術(shù)[51-52]實(shí)現(xiàn)多通道的快速檢測(cè)能力,使碳點(diǎn)可作為優(yōu)異的標(biāo)記物用于金屬離子、有機(jī)小分子、有機(jī)大分子、微生物等快速精準(zhǔn)的檢測(cè)。在有機(jī)大分子方面還存在檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)等問(wèn)題,期望在后續(xù)的研究中通過(guò)加入一些試劑加速反應(yīng),壓縮檢測(cè)時(shí)間實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。在細(xì)菌檢測(cè)方面期望開(kāi)發(fā)出既能實(shí)現(xiàn)細(xì)菌精準(zhǔn)檢測(cè)又具有殺菌抑菌功能的碳點(diǎn),以實(shí)現(xiàn)更好的應(yīng)用價(jià)值。