許娟秀， 吳海根

(江西省婦幼保健院腫瘤科，江西 南昌 330006)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最嚴重的惡性腫瘤之一。全球每年超過125 000例死于卵巢癌[1]，而在中國，近年來卵巢癌的發(fā)病率持續(xù)上升[2]。目前的首要臨床問題是提高患者的早期診斷和療效。近年來，手術聯(lián)合藥物治療可改善患者的預后，但晚期卵巢癌的5年生存率仍小于30%[3]。因此，迫切需要更好地理解發(fā)病機理和鑒定分子改變，以開發(fā)有助于卵巢癌診治的有效策略。

藤黃酸(Gambogic acid，GA)已被多次報道可在卵巢癌中扮演抗癌作用[4-5]。但是其抗癌的內在分子機制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細胞中藤黃酸可以促進抗癌長鏈非編碼RNA(lncRNA)GAS5水平的表達[6]。而GAS5又可以通過調節(jié)miRNA和靶基因參與介導膀胱癌和卵巢癌中的抗癌機制[6-7]。GAS5和藤黃酸都具有較明顯的抗炎、抗增殖、抗侵襲和遷移的能力[8-9]。因此藤黃酸很可能在卵巢癌中同樣調節(jié)GAS5的表達，但在藤黃酸是否通過調節(jié)GAS5介導卵巢癌進展方面缺乏報道。

本研究使用藤黃酸處理卵巢癌細胞，觀察NF-κB的激活狀態(tài)、細胞炎癥狀態(tài)、以及增殖和轉移標記物的變化，并基于lncRNAGAS5研究藤黃酸介導的卵巢癌細胞功能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 組織 2016年7月至2018年12月，從江西省婦幼保健院醫(yī)院接受手術的患者中獲得12例卵巢癌組織和相鄰正常組織。根據(jù)組織病理學診斷為卵巢癌(Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ期)根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)的標準進行評估。手術前未對這些患者進行局部或全身治療。收集組織并立即在液氮中冷凍，儲存在-80 ℃。本研究經(jīng)江西省婦幼保健院研究倫理委員會批準，每個參與者都獲得知情同意。

1.2 細胞系 人卵巢表面上皮細胞(HNOECs)和卵巢癌細胞系SW626分別購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和中國科學院細胞庫，根據(jù)供應商的說明培養(yǎng)卵巢癌細胞。在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中(美國Gibco公司)常規(guī)培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基均含1%青-鏈霉素(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，將所有細胞培養(yǎng)于補充有5%CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中。

1.3 藥物 藤黃酸購于上海阿拉丁生化科技有限公司(G101480)，處理SW626細胞，濃度為每孔100 μg/2×104cells，分為對照組和藤黃酸組，分別處理6、12、24 h。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析 使用TRIzol試劑(美國英杰生命科技有限公司)從組織樣品或培養(yǎng)的細胞中提取總RNA。使用Reverse Transcription試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]將2 μg總RNA用于逆轉錄反應和cDNA合成。使用SYBR-Green Real-Time Master Mix(日本TaKaRa公司)進行實時熒光定量PCR分析。將結果標準化為組成型表達基因GAPDH。GAS5引物正向5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，反向5′-TTGTGCCATG AGACTCCATCAG-3′；MMP-2引物正向5′-TGGCAGTGCAA TACCTGAAC-3′，反向5′-CCGTACTTGCCATCCTTCTC-3′；MMP-9引物正向5′-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3′，反向5′-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3′’；GAPDH引物正向5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′，反向5′-TTACTCCTTGGAG GCCATGT-3′；U6引物5′-GCTCTAGATTTGATCCGACGCC GCCATCTC-3′。在Applied Biosystems 7500序列檢測系統(tǒng)(美國ABI公司)上進行RT-qPCR和數(shù)據(jù)收集。計算GAS5的相對表達并使用2-ΔΔCt方法相對于GAPDH標準化。

1.5 CCK-8細胞增殖實驗 根據(jù)制造商的說明書，用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(日本同仁化學研究所)進行細胞增殖測定。將每孔2×104個細胞接種在96孔板中。接種后24 h內的三個間隔用CCK-8評估細胞活力。CCK-8在37 ℃處理1 h后，使用酶標儀測450 nm處的吸光度。

1.6 MTT細胞毒性實驗 采用MTT法檢測藤黃酸對正常卵巢細胞系IOSE386(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)的細胞毒性。IOSE386細胞用10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期的細胞以每孔7×103個密度接種于96孔板，過夜培養(yǎng)使細胞貼壁。然后棄去培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的不同質量濃度藤黃酸，每個質量濃度設置6個平行，空白對照只加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL質量濃度為500 μg/mL的MTT溶液。培養(yǎng)4 h，吸去MTT，PBS清洗，加入100 μL DMSO，用酶標儀測量580 nm處的OD值，計算細胞的存活率。細胞存活率=[OD(加藥孔)/OD(空白孔)]×100%。

1.7 蛋白質提取和蛋白免疫印跡檢測 用SDS裂解緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司)在冰上將培養(yǎng)的細胞中提取總蛋白質20 min，并使用BCA蛋白質測定試劑盒(美國Pierce公司)測定蛋白質質量濃度。為檢測p-p65的表達，使用核蛋白和胞漿蛋白抽提試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)提供的具體步驟對核蛋白進行抽提，并存儲在-70 ℃以進行下一步實驗。通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的總蛋白質，轉移至0.22 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore Corp公司)并與特異性第一抗體(美國Abcam公司)一起室溫孵育8 h。PBS洗掉一抗，經(jīng)過熒光二抗(上海碧云天生物技術有限公司)孵育2 h后，通過增強化學發(fā)光(ECL)檢測蛋白質，并通過光密度測定法(Quantity One軟件；美國Bio-Rad公司)定量條帶的強度。 GAPDH抗體(1∶2 000)用作總蛋白的內參蛋白，Lamin A作為核蛋白的內參蛋白。測定MMP-2(1∶1 500)、MMP-9(1∶1 000)、VEGF(1∶800)，側支發(fā)芽因子同源物2(Sprouty homolog2，SPRY2)(1∶900)，p-p65(1∶800)蛋白表達。

對供試種子樣品進行處理，種子發(fā)芽勢統(tǒng)計分析結果見表3。結果表明，不同處理上杭錐種子發(fā)芽勢為7.61%～85.20%，處理6發(fā)芽勢最高為85.20%。從R值可以得出，不同因素對上杭錐種子發(fā)芽勢影響的主次順序為B>A>C>D，依次為浸種溫度、粒級分類、GA3濃度、萌發(fā)溫度處理。根據(jù)各因素水平的平均值(ki)的大小比較可得最優(yōu)水平組合為A1B2C1D2，即大粒種子在30℃溫度下浸種后瀝干，加入50mg·l-1GA3溶液浸種24h，放在萌發(fā)溫度20℃的人工氣候箱內萌發(fā)，種子發(fā)芽勢最高。進一步經(jīng)方差分析，浸種時間對上杭錐種子發(fā)芽勢的影響是極顯著 (P=0.0096< 0.01)。

1.8 質粒構建細胞轉染 構建GAS5的siRNA，合成人GAS5完整序列(2 651 bp)并亞克隆到siRNA載體中。另外，通過DNA測序確認質粒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。將卵巢癌細胞接種于24孔板(每孔1×105個細胞)中并孵育24 h，然后使用Lipofectamine 2000(美國英杰生命科技有限公司)轉染si-GAS5(每孔2 μg/2×104cells)或陰性對照(si-NC，每孔2 μg/2×104cells)到細胞內。按照制造商的說明書在無血清培養(yǎng)基中進行孵育。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附檢測 將各組細胞離心，取上清液，使用IL-6和IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒(上海江林生物科技有限公司)，嚴格按照制造商的說明進行檢測，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中人白介素的質量濃度。

2 結果

2.1 藤黃酸促進卵巢癌細胞SW626中的GAS5的表達 使用RT-qPCR檢查12例配對的人卵巢癌組織和相匹配的癌旁正常組織中GAS5的表達。如圖1A所示，與相應的相鄰組織學正常組織比較，卵巢癌組織中GAS5的表達下調(P<0.05)。其次，檢測卵巢癌細胞系SW626和正常卵巢細胞中GAS5的表達差異，與正常卵巢細胞比較，SW626中GAS5的表達同樣下調(圖1B，P<0.05)。另外，在藤黃酸(6、12、24 h)刺激下，GAS5的表達呈時間依賴性升高(圖1C，P<0.05)。

注：A為卵巢癌組織和相應癌旁正常組織(n=12)中GAS5的表達，與癌旁正常組織比較，*P<0.05；B為卵巢癌細胞中GAS5表達，與人卵巢表面上皮細胞比較，*P<0.05；C為藤黃酸(每孔100 μg/2×104 cells)對卵巢癌細胞中GAS5表達的影響，與對照組比較，*P<0.05；與藤黃酸-6 h比較，#P<0.05；與藤黃酸-12 h比較，&P<0.05。圖1 藤黃酸對卵巢癌細胞中l(wèi)ncRNA GAS5表達的影響

2.2 藤黃酸抑制卵巢癌細胞SW626的增殖和轉移相關指標 采用CCK-8實驗檢測藤黃酸對卵巢癌細胞增殖能力的影響，分析與對照組比較，藤黃酸處理后細胞在6、12、24 h增殖率均下調(圖2A，P<0.05)；藤黃酸分別在每孔10、50、100、200、300、400、500、600 μg/2×104cells濃度下處理正常卵巢細胞IOSE386，增殖率均未降低(圖2B，P>0.05)；藤黃酸處理24 h后，MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表達均下調(圖2C～2F，P<0.05)。

注：A為CCK-8用于檢測藤黃酸(每孔100 μg/2×104 cells)處理不同時間卵巢癌細胞的成活率，B為MTT法檢測藤黃酸(每孔10～600 μg/2×104 cells)處理卵巢細胞IOSE386的成活率，RT-qPCR檢測卵巢癌細胞中MMP-2(C)、MMP-9(E)mRNA表達，Western blot檢測卵巢癌細胞中MMP-2(D)、MMP-9(F)蛋白表達。與對照組比較，*P<0.05。圖2 藤黃酸對卵巢癌細胞成活率和MMP-2及MMP-9表達的影響(n=3)

2.3 藤黃酸抑制卵巢癌細胞SW626的炎癥水平 藤黃酸刺激24 h后，與對照組比較，p-p65核表達降低(圖3A，P<0.05)，炎癥因子水平IL-6、IL-1β降低(圖3B～3C，P<0.05)。

注：A為Western blot檢測卵巢癌細胞核中p-p65表達，ELISA檢測卵巢癌細胞培養(yǎng)物上清液中IL-6(B)、IL-1β(C)水平。與對照組比較，*P<0.05。圖3 藤黃酸對卵巢癌細胞中炎癥反應的影響(n=3)

2.4 沉默GAS5恢復卵巢癌細胞的增殖，轉移相關指標和炎癥因子的表達siGAS5轉染卵巢癌細胞并聯(lián)合藤黃酸處理，使用CCK-8檢測GAS5沉默對卵巢癌細胞增殖能力的影響，結果顯示，與單獨藤黃酸處理24 h組比較，siGAS5+藤黃酸處理后細胞在24 h增殖率上調(圖4A，P<0.05)，MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白表達增加(圖4B～4D，P<0.05)。與單獨藤黃酸處理24 h組比較，藤黃酸+siGAS5組p-p65核表達部分升高，IL-6、IL-1β水平部分上調(圖4E～4G，P<0.05)。

注：A為CCK-8檢測卵巢癌細胞的成活率，Western blot檢測卵巢癌細胞中MMP-2(B)、MMP-9(C)、VEGF(D)蛋白及細胞核中p-p65蛋白(E)表達，ELISA檢測卵巢癌細胞培養(yǎng)物上清液中IL-6(F)、IL-1β(G)水平。與對照組比較，*P<0.05；與藤黃酸組比較，#P<0.05；與藤黃酸+si-GAS5比較，&P<0.05。圖4 沉默GAS5恢復卵巢癌細胞成活率(n=3)

2.5GAS5敲低減弱藤黃酸對miR-21和SPRY2的調控作用 miR-21在SW626細胞中表達升高，SPRY2表達則降低(P<0.05)。在藤黃酸處理24 h后細胞中miR-21表達降低，SPRY2表達升高(P<0.05)。在藤黃酸+si-GAS5轉染處理24 h細胞中miR-21表達升高，SPRY2表達降低(P<0.05)。見圖5。

注：A、C為RT-qPCR法檢測卵巢癌細胞中miR-21表達，B、D為Western blot檢測SPRY2的蛋白表達。與對照組比較，*P<0.05；與藤黃酸組比較，#P<0.05；與藤黃酸+si-GAS5比較，&P<0.05。圖5 GAS5敲低減弱藤黃酸對miR-21和SPRY2的調控作用(n=3)

3 討論

研究表明，中藥單體化合物可能在治療癌癥中起重要作用[10]。藤黃酸是一種多靶標的化合物，具有抗腫瘤活性[5，11]。研究表明藤黃酸可在體內外抑制卵巢癌腫瘤的生長[5]。本研究確定了藤黃酸對卵巢癌細胞炎癥、細胞增殖、以及轉移標志物表達水平的影響，進一步明確lncRNA GAS5的異常表達以及其介導的miR-21/SPRY2軸可能是藤黃酸調節(jié)卵巢癌細胞功能的關鍵下游機制之一。

多項證據(jù)表明，藤黃酸不僅抑制腫瘤細胞增殖、促進多種腫瘤細胞凋亡，且不良反應較少[12-13]。本研究以每孔100 μg/2×104cells的藤黃酸分別處理卵巢癌細胞6、12、24 h后，卵巢癌細胞的增殖能力以時間依賴性下調。另外，腫瘤細胞轉移標志物MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達均被藤黃酸所抑制。由此提示，藤黃酸可以作為潛在的抗卵巢癌新藥物。

近年來研究表明，lncRNA在細胞的基本生物學過程中起重要作用，如影響表觀遺傳信息、促進細胞生長[14-15]。

在多種腫瘤惡性進展過程中頻繁出現(xiàn)lncRNA表達失調現(xiàn)象，可能對腫瘤的發(fā)展起關鍵作用[16]。lncRNA GAS5全稱為生長停滯特異性5，被發(fā)現(xiàn)可作為潛在的腫瘤抑制基因，其在生長停滯的細胞中高表達[17-18]，在乳腺癌和前列腺癌等癌癥中異常表達[19-20]，對不同類型的癌細胞生長具有抑制作用，其中包括卵巢癌細胞[6-7]。本研究證明GAS5在卵巢癌中被下調，而且藤黃酸可以恢復GAS5在卵巢癌細胞中的表達。為進一步驗證藤黃酸是通過上調GAS5參與抑制卵巢癌細胞的惡性特征，本研究在藤黃酸處理卵巢癌細胞的基礎上同時改變GAS5的表達，結果表明沉默GAS5的表達可以在較大程度上逆轉藤黃酸對卵巢癌細胞表型的影響，包括部分恢復細胞生長，恢復細胞轉移標記物MMP-2、MMP-9和VEGF。抑制GAS5的水平可提高卵巢癌細胞的遷移、侵襲能力和增殖能力[8]，本研究結果表明，藤黃酸通過調節(jié)lncRNA GAS5參與抑制卵巢癌細胞的惡性特征。

NF-κB可被不同的內源性或外源性因子激活從而刺激細胞，促進一系列促炎和抗凋亡相關基因的表達。研究表明，NF-κB信號通路在各種腫瘤的發(fā)展中起著重要作用，在晚期可以促進腫瘤的惡性進展[21]。在本研究中，藤黃酸能抑制細胞核中磷酸化p65的表達以及促炎癥因子IL-6和IL-1β的水平，說明NF-κB信號通路的失活可能是藤黃酸對于卵巢癌的抑制作用的關鍵機制之一。沉默GAS5的表達可逆轉藤黃酸對卵巢癌細胞磷酸化p65表達及促炎癥因子IL-6和IL-1β水平的抑制作用，表明藤黃酸可通過調節(jié)lncRNA GAS5介導抑制卵巢癌細胞炎癥反應。

GAS5在卵巢癌中已被證實可以抑制miR-21并促進SPRY2基因表達，從而在卵巢癌細胞中扮演內源競爭性RNA的角色調節(jié)腫瘤細胞的增殖[7]。基于本研究所得到的藤黃酸可正向調節(jié)GAS5的結論，進一步驗證藤黃酸對卵巢癌細胞中miR-21和靶基因SPRY2水平的影響，最終確定藤黃酸不僅上調GAS5水平，且抑制miR-21/SPRY2表達水平的比值。表明藤黃酸可能直接調控了GAS5/miR-21/SPRY2軸的表達水平。

綜上所述，藤黃酸可阻止卵巢癌細胞過度增殖、細胞轉移和細胞炎癥的激活，上調lncRNA GAS5是藤黃酸發(fā)揮體外抑制卵巢癌增殖、轉移、炎癥功能的關鍵機制之一，為卵巢癌的藥物治療提供了新的理論基礎、潛在的檢測和治療靶點。