陳融超　周連鎖

1研究背景

結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer）是世界上最高發(fā)的癌癥類型之一，約占所有新癌癥病例的10%和所有癌癥死亡病例的8.5%。在中國，結(jié)直腸癌位居我國惡性腫瘤發(fā)病第三位，其發(fā)病率達(dá)28.2/10萬，年發(fā)病數(shù)為38.8萬例，且發(fā)病率呈上升趨勢，死亡率為13.61/10萬，年死亡數(shù)為18.7萬例，在因惡性腫瘤致死原因中排行第五。結(jié)直腸癌治療以手術(shù)為主，化療和放療為輔，但傳統(tǒng)的手術(shù)切除帶來的如吻合口出血、術(shù)后腸梗阻等并發(fā)癥，很大程度上增加了患者的痛苦。同時(shí)，結(jié)直腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的問題嚴(yán)重影響預(yù)后，轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌致死的最主要原因.約有50%的患者可出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，其中同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移達(dá)15%～25%。

光熱治療（Photothermal Therapy，PTT）是在臨床上繼手術(shù)、放療和化療之后的新興治療手段。其作為一種新型的利用光熱轉(zhuǎn)換劑吸收光能并產(chǎn)熱來起到治療效果的無創(chuàng)腫瘤治療手段，對于治療淺表性腫瘤具有良好的效果。該治療方法最具優(yōu)勢的特點(diǎn)是無創(chuàng)，引起患者全身系統(tǒng)性損傷小、并發(fā)癥少，光熱治療不僅能殺滅癌細(xì)胞，還可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，具有精確性高、可控性強(qiáng)、副作用小等特點(diǎn)。光熱轉(zhuǎn)換劑是光熱治療中的關(guān)鍵性材料.理想光熱轉(zhuǎn)化劑應(yīng)具有以下特點(diǎn)：（1）在近紅外光窗口（650～950nm）具有較強(qiáng)的吸收能力和較高的光熱轉(zhuǎn)換效率;（2）生物安全性高;（3）生物穩(wěn)定性強(qiáng);（4）在惡性腫瘤組織中保留時(shí)間長。其中，聚多巴胺是一種較為理想的光熱轉(zhuǎn)化劑。聚多巴胺是黑色素的主要成分，具有較廣的光譜吸收性、光熱轉(zhuǎn)化效率高、生物相容性優(yōu)異，在體內(nèi)可降解等特點(diǎn)，非常適合用于光熱治療。本研究利用聚多巴胺對結(jié)直腸癌SW480、SW620細(xì)胞進(jìn)行光熱干預(yù)，以探索其對結(jié)直腸癌的治療效果。

2研究方法

2.1材料

聚多巴胺納米顆粒由本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行合成，完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基（hyclone）、MTT、青霉素、鏈霉素、胎牛血清（FBS）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。胎牛血清（FBS）購買于浙江天杭生物科技股份有限公司。人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、SW620由空軍軍醫(yī)大學(xué)提供。

2.2 MTT法檢測聚多巴胺對SW480、SW620細(xì)胞的毒性

采用復(fù)蘇的人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、SW620為樣品，在含10%胎牛血清、濃度為0.1mg/mL的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并將其放置于條件為37℃，5%CO，的無菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長狀況。在細(xì)胞長至鋪滿培養(yǎng)皿80%以上后進(jìn)行傳代。將傳代后培養(yǎng)36h左右的細(xì)胞用胰酶消化，以每孔1×10⁴個(gè)細(xì)胞的密度鋪入平底96孔板內(nèi)，加入含有不同濃度梯度聚多巴胺納米顆粒的培養(yǎng)基（81，27，9，3，1μ/mL），繼續(xù)培養(yǎng)96h。培養(yǎng)結(jié)束后去除培養(yǎng)基，每孔重新加入200μL含有濃度為100ng/mLMTT的完全培養(yǎng)基，并培養(yǎng)4h。去除培養(yǎng)基后，每孔加入100mL DMSO，放置于水平振蕩儀上振蕩處理10min后利用酶標(biāo)儀測定每孔在490nm處的吸光值。計(jì)算IC₅₀值。

2.3聚多巴胺光熱干預(yù)效果檢測

2.3.1不同濃度的聚多巴胺光熱劑干預(yù)效果檢測

將人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、SW620鋪至24孔板，1×10⁵個(gè)/孔，分為5組，第1組為空白對照組，2～5組分別加入不同濃度的聚多巴胺光熱劑（200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL），采用照射功率為1W/cm²，激光波長為808nm的激光發(fā)射器照射處理6min。輻照完畢后繼續(xù)孵育12h，去除孔內(nèi)的培養(yǎng)基，參照前述MTT法測定抑制率。根據(jù)前期所確定的聚多巴胺的最適藥物濃度.設(shè)置不同的輻照時(shí)長和輻照功率，間隔時(shí)長與功率分別為2min以及0.4W，以前述同樣MTT法測定并計(jì)算抑制率。

2.3.2不同輻照時(shí)間干預(yù)效果檢測

在2塊24孔板內(nèi)分別均勻鋪人人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、SW620，密度為1×10⁵個(gè)/孔，分為5組，第1組為空白對照組，不進(jìn)行照射。第二組照射時(shí)長為1min，第三組照射時(shí)長為2min，第四組照射時(shí)長為3min，第五組照射時(shí)長為4min，第六組照射時(shí)長為5min。每孔加入1mL濃度為100μm/L的聚多巴胺光熱劑。第二至六組每孔均以808nm的激光進(jìn)行照射處理，照射功率為1W/cm²。照射完畢繼續(xù)孵育12h，以前述同樣MTT法測定并計(jì)算抑制率。

2.3.3不同輻照功率干預(yù)效果檢測

在2塊24孔板內(nèi)分別均勻鋪入人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、SW620，密度為1×10⁵個(gè)/孔，分為5組。設(shè)置第1組為空白對照，第2～6組輻照功率分別為0.2w/cm²、0.6W/cm²、1.0W/cm²、1.4W/cm²、1.8w/cm²。每孔加入1mL含有100μg聚多巴胺光熱劑的無色培養(yǎng)基。使用波長為808nm的激光發(fā)射器，在上述不同功率下對第2～6組進(jìn)行2min的照射處理。處理后放回培養(yǎng)箱孵育12h，以前述同樣MTT法測定并計(jì)算抑制率。

3結(jié)果

3.1聚多巴胺對SW480、SW620細(xì)胞增殖的抑制效果

聚多巴胺針對SW480、SW620細(xì)胞未顯示出抑制效果，其在SW480、SW620細(xì)胞上的IC₅₀值均超過500μg/mL。表明了聚多巴胺在非光照條件下具有毒性低的特點(diǎn)，生物安全性高。

3.2聚多巴胺對SW480、SW620細(xì)胞的光熱干預(yù)效果

在同等光照功率和時(shí)長下，聚多巴胺的濃度越高，細(xì)胞存活率越低。最高濃度處理組細(xì)胞存活率低于10%，最低濃度組70%細(xì)胞存活，同等藥物濃度和光熱下SW480、SW620細(xì)胞存活率未顯示出顯著的差異。該結(jié)果證明了細(xì)胞存活率與聚多巴胺納米粒子濃度之間存在著顯著的量效關(guān)系，表明了聚多巴胺具有較好的光熱轉(zhuǎn)換特性.能將光能很好的轉(zhuǎn)化為熱能。并且其發(fā)熱抑制腫瘤效果明顯，對細(xì)胞殺傷作用隨濃度的升高而增大。

根據(jù)前面結(jié)果，選出100μg/mL的聚多巴胺進(jìn)行光輻射時(shí)長測試。細(xì)胞存活率與光輻射時(shí)長之間存在著顯著的量效關(guān)系，光輻射時(shí)長越長，細(xì)胞存活率越低。照射10min后細(xì)胞僅有9.7%的存活率，且狀態(tài)很差。同等條件下僅進(jìn)行光輻射的SW480、SW620細(xì)胞存活率沒有顯示出顯著的差異。隨時(shí)間的增加，聚多巴胺能更好地將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熱能，從而進(jìn)行細(xì)胞殺傷。

細(xì)胞存活率隨著光輻照功率的增加在一定范圍內(nèi)逐漸降低，超過1.4W/cm²后未發(fā)現(xiàn)顯著存活率差異。

4討論

目前結(jié)直腸癌多采用手術(shù)、化療和放療等進(jìn)行綜合性治療，但這些治療方法均有其局限性。手術(shù)具有較大的損傷性，術(shù)后并發(fā)癥以及肝轉(zhuǎn)移對患者存在著較大的威脅，其中，轉(zhuǎn)移病灶切除不徹底、只能行姑息性輔助化療等情況依舊存在：而化療效果則受毒性和耐藥性所限制;外放射療法在初次進(jìn)行手術(shù)后可有效降低其復(fù)發(fā)率，但行肝切除術(shù)后，受個(gè)體差異以及放射劑量等因素影響，肝臟仍可產(chǎn)生如腹水、肝大等并發(fā)癥，導(dǎo)致患者預(yù)后較差，生活質(zhì)量較低等問題。納米材料介導(dǎo)的光熱治療已成為一些不可切除的實(shí)體瘤的替代療法，其作為一種無創(chuàng)的治療手段，具有明顯的腫瘤治療優(yōu)勢，較強(qiáng)的可控制性可以降低系統(tǒng)毒性并極大減少對正常組織的損傷，可極大地減少患者的痛苦，提高生活質(zhì)量。多巴胺作為黑色素的組成成分在人體內(nèi)大量存在，而聚多巴胺納米顆粒是人工合成黑色素樣納米顆粒的出色代表，其安全性和光熱轉(zhuǎn)換效能已被廣泛認(rèn)可。利用聚多巴胺納米顆粒進(jìn)行光熱治療，在腫瘤治療方面具有廣闊的臨床研究前景。

本實(shí)驗(yàn)通過制備的聚多巴胺納米顆粒對結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行光熱干預(yù)研究。研究結(jié)果表明，聚多巴胺可有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、SW620的增殖。聚多巴胺納米顆粒在非光熱照射條件下毒性極低，而在光熱照射條件下顯示出對細(xì)胞的殺傷作用，且光熱殺傷效果隨時(shí)問和聚多巴胺納米粒子濃度的升高而增加，合適的光輻射時(shí)間和藥物濃度可使聚多巴胺將所吸收的光能充分轉(zhuǎn)化成可殺傷腫瘤細(xì)胞的有效熱能。實(shí)驗(yàn)表明聚多巴胺對結(jié)直腸癌有明顯的干預(yù)效果，并且充分展示了聚多巴胺的高生物安全性、高光熱轉(zhuǎn)化能力、高光熱轉(zhuǎn)化效率以及可控性，該研究結(jié)果可為日后的結(jié)直腸癌臨床治療新方法提供有效的參考。