吳志兵，牛 雪，楊晶欣，謝德文，張承志

(1.貴州大學(xué) 綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程國家重點實驗室培育基地，教育部綠色農(nóng)藥與生物工程重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 精細(xì)化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 化工學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

自2009年國際真菌劑抗性行動委員會(fungicide resistance action committee，F(xiàn)RAC)首次將具有抑制琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)的酰胺類化合物命名為琥珀酸脫氫酶抑制劑(succinate dehydrogenase inhibitors, SDHIs)以來，已有23個商品化的殺菌劑面市[1-3]。隨著越來越多的商品化的殺菌劑應(yīng)用到實際生產(chǎn)中，該類化合物的抗性問題也日漸凸顯出來[4-6]。而如何在原有的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，設(shè)計出結(jié)構(gòu)新穎且無交互抗性的化合物也成為了當(dāng)前科研人員所面臨的挑戰(zhàn)。

通過對商品化的琥珀酸脫氫酶抑制劑的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，有10個是吡唑酰胺類化合物。所有吡唑酰胺類化合物中，吡唑環(huán)的“1-位”的取代基均為“甲基”，而在吡唑環(huán)的“3-位”具有“CHF2”或“CF3”取代基的有6個；在“3-位”和“5-位”同時具有2個取代基的有4個；但是沒有一個吡唑酰胺類化合物是僅有“5-位”取代的[7-8]。本課題組基于此分析，在前期的工作中設(shè)計合成了系列1-取代-5-三氟甲基-4-吡唑酰胺類化合物，生物活性測試結(jié)果表明該類化合物表現(xiàn)出良好的抗植物病原真菌活性[8-11]。

為了尋找高效、低毒、廣譜且作用機(jī)理獨特新穎的吡唑酰胺類殺菌劑，在課題組前期工作基礎(chǔ)上[8]，保留了吡唑環(huán)“1-位”和“5-位”的取代基，而將“酰胺”胺部分的“吡啶基”替換為“取代苯基”，設(shè)計并合成了9個N-取代苯基-5-三氟甲基-4-吡唑酰胺類化合物，對所有目標(biāo)化合物進(jìn)行了抗植物真菌的生物活性測定，期望發(fā)現(xiàn)更高活性的吡唑酰胺類化合物，為新農(nóng)藥的創(chuàng)制及衍生工作提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 合成路線

目標(biāo)化合物的合成路線如圖1所示。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.1 Synthetic route of the target compounds

1.2 儀器與試劑

1H NMR、13C NMR和19F NMR數(shù)據(jù)由Bruker Biospin AG-400型核磁共振儀(瑞士Bruker公司，TMS為內(nèi)標(biāo)，DMSO-d6為溶劑)測定，熔點由X-4型顯微熔點測定儀(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司，溫度計未校正)測定。所用試劑和溶劑均為市售化學(xué)純或分析純，使用前經(jīng)常規(guī)處理，其中四氫呋喃經(jīng)金屬鈉除水處理。

1.3 供試真菌和對照藥劑

植物真菌：小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、茄子黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)和油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

對照藥劑：萎銹靈(98%原藥，阿拉丁試劑上海有限公司)。

1.4 中間體的制備[8,12]

1.4.1中間體2的合成

在帶有冷凝管、溫度計的250 mL三口瓶中，依次緩慢加入三氟乙酰乙酸乙酯 (9.2 g, 0.05 mol)，原甲酸三乙酯 (23.2 g, 0.10 mol)和醋酸酐 (15.3 g, 0.15 mol)，加熱至100 ℃，反應(yīng)12 h, 薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)檢測反應(yīng)結(jié)束，降至常溫，減壓蒸餾出溶劑及過量的原甲酸三乙酯，剩余物未經(jīng)純化直接溶于100 mL無水乙醇，苯肼 (6.0 g, 0.55 mol)緩慢加入反應(yīng)液中，加熱回流5 h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入水，乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾，除去有機(jī)溶劑，粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析(乙酸乙酯/石油醚=1/20)分離純化得中間體2，黃色油狀物，收率 72%。1H NMR (DMSO-d6) δ: 8.31 (s, 1H, pyrazole H), 7.63～7.54 (m, 5H, benzene H), 4.32 (q,J=7.2 Hz, 2H, CH2), 1.31 (t,J=7.2 Hz, 3H, CH3)。

1.4.2中間體3的合成

在帶有冷凝管和溫度計的250 mL三口瓶中，加入中間體2(8.5 g, 0.03 mol)，四氫呋喃 (40 mL)， H2O (40 mL)，攪拌下緩慢加入無水氫氧化鋰(2.86 g, 0.12 mmol)， 加熱至70 ℃，反應(yīng)4 h, TLC檢測反應(yīng)結(jié)束，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃，反應(yīng)液冷卻，1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至4，析出大量固體，過濾，固體用水洗滌，干燥后得中間體3，黃色固體，收率92%，熔點191～192 ℃。1H NMR (DMSO-d6) δ: 13.38 (s, 1H, COOH), 8.25 (s, 1H, pyrazole H), 7.62～7.53 (m, 5H, benzene H)。

1.4.3中間體4的合成

中間體酰氯4由中間體3在二氯亞砜中回流4 h制得。

1.5 目標(biāo)化合物5a—5i的合成[9-11]

在25 mL的反應(yīng)瓶中，加入取代苯胺 (1 mmol)和10 mL干燥的四氫呋喃，冰浴下分別緩慢加入80% NaH (1.5 mmol)和中間體4(1 mmol)，升溫至室溫，反應(yīng)10 h，TLC檢測結(jié)束反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，殘留物溶解至乙酸乙酯中，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析(乙酸乙酯/石油醚=1/15～1/30) 純化，得到目標(biāo)化合物5。目標(biāo)化合物5a—5i的結(jié)構(gòu)及理化數(shù)據(jù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)及1H、13C 和19F NMR數(shù)據(jù)Tab.1 The structures, 1H, 13C and 19F NMR data of the target compounds

續(xù)表

1.6 抑菌活性測試

采用菌絲生長速率法[8]測定了目標(biāo)化合物對小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、茄子黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)和油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)的抑制活性，具體實驗方法如下。

PDA培養(yǎng)基的配制：稱取800 g去皮土豆，煮汁后過濾，加入瓊脂80 g、葡萄糖80 g，混勻溶解后以每瓶90 mL轉(zhuǎn)移到200 mL錐形瓶中，封口后在120 ℃條件下高壓滅菌30 min，冷卻后備用。

藥液的配制：稱取待測化合物10 mg溶解到1.0 mL DMSO中，在無菌超凈臺中轉(zhuǎn)移至含9.0 mL無菌吐溫水的15 mL離心管中，再加到已滅菌的90 mL PDA培養(yǎng)基中混勻，使得藥液最終濃度為100 μg/mL，將培養(yǎng)基平均倒入9個培養(yǎng)皿中冷卻備用，以等量的DMSO吐溫水作為空白對照，以商品藥萎銹靈作為對照藥劑。

抑菌活性測試：取提前活化好的真菌邊緣打孔制成直徑為4.0 mm的菌餅，用無菌接種針移接到含藥培養(yǎng)基中央，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～6 d。待空白對照組菌落長到6.0 cm左右時，用直尺按十字交叉法測量菌絲直徑。根據(jù)公式計算抑制率，計算公式如下：

I=(C-T)/(C-0.4)×100%

式中：I為抑制率；C為空白對照菌絲測量直徑，cm；T為藥物處理組測量直徑，cm。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

以三氟乙酰乙酸乙酯和原甲酸三乙酯為原料，與苯肼閉環(huán)生成1-苯基-5-三氟甲基-4-吡唑酸乙酯2，在無水氫氧化鋰的條件下，脫酯，生成1-苯基-5-三氟甲基-4-吡唑甲酸3，以二氯亞砜為溶劑和反應(yīng)試劑制得吡唑甲酰氯4，與不同的取代苯胺反應(yīng)得到目標(biāo)化合物5a—5i，產(chǎn)率為55%～79%。其中，吡唑甲酰氯4的制備中，二氯亞砜需重蒸后使用，否則會影響下一步反應(yīng)的產(chǎn)率；而目標(biāo)化合物的合成過程中，溶劑為已除水的四氫呋喃，堿是NaH，若溶劑中含水則反應(yīng)產(chǎn)率會明顯降低。

2.2 生物活性測試

采用離體生長速率法，在100 μg/mL的濃度下對目標(biāo)化合物進(jìn)行5種植物病原真菌的抑菌活性測試，測試結(jié)果如表2所示。

表2 目標(biāo)化合物對5種植物病原真菌的抑制活性結(jié)果Tab.2 Inhibition rates of target compounds against five plant pathogenic fungi

生物活性測試結(jié)果表明：當(dāng)“酰胺”鍵的胺部分由“取代吡啶基”替換為“取代苯基”后，大部分目標(biāo)化合物對所測試的5種植物病原真菌的抑制活性明顯下降；但化合物5d對茄子黃萎病菌和水稻紋枯病菌依然保持了一定的抑菌活性，在100 μg/mL的濃度下，對這2種植物病原真菌的活性分別為51.5%和65.8%，均低于對照藥劑萎銹靈(98.7%和88.3%)。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在苯基的鄰位引入“甲硫醚”結(jié)構(gòu)后，化合物5d依然保持了一定的抑制真菌活性。

3 結(jié)果與討論

以三氟乙酰乙酸乙酯和原甲酸三乙酯為原料，設(shè)計、合成了一系列N-取代苯基-5-三氟甲基-4-吡唑酰胺類化合物。對目標(biāo)化合物的抗植物病原真菌測試結(jié)果表明：當(dāng)“酰胺”鍵的胺部分替換為“取代苯基”后，大部分目標(biāo)化合物對所測試的5種植物病原真菌的抑制活性明顯下降；但在苯基的鄰位引入“甲硫醚”結(jié)構(gòu)后，化合物5d對茄子黃萎病菌和水稻紋枯病菌依然保持了一定的抑菌活性。在100 μg/mL的濃度下，化合物5d對這2種植物病原真菌的活性分別為51.5%和65.8%，均低于對照藥劑萎銹靈(98.7%和88.3%)。該研究為下一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了一定基礎(chǔ)。