齊素敏 冉新炎 韓廣泉 陶寧 陳丹丹 李圓圓 王麗榮

摘要：本研究測(cè)定哈茨木霉NBL-Z1菌株無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)5種病原菌的拮抗活性，并檢測(cè)該菌的定殖能力及對(duì)草莓根腐病的防治效果，以期篩選出對(duì)病原真菌具有良好拮抗效果、安全、高效的生防菌。結(jié)果表明，哈茨木霉NBL-Z1菌株無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)5種供試病原真菌有較強(qiáng)的拮抗作用，處理96、144 h，NBL-Z1菌株對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率均為100.00%;接種后28 d，菌株NBL-Z在草莓根表定殖數(shù)量達(dá)到最大，為8.10×107 CFU/g;NBL-Z1菌株對(duì)盆栽草莓根腐病的防效為65.6%，同時(shí)可促進(jìn)盆栽草莓植株生長(zhǎng)，提高果實(shí)產(chǎn)量。研究表明，NBL-Z1菌株能有效防治草莓根腐病并促進(jìn)草莓植株生長(zhǎng)，具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：哈茨木霉;拮抗活性;尖孢鐮刀菌;定殖能力;草莓根腐病

中圖分類號(hào)：S436.68+4?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）17-0124-04

收稿日期：2020-12-15

基金項(xiàng)目：山東省2018年重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018JHZ012）;泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才（編號(hào)：魯政辦字〔2018〕246號(hào)）;2017年“外專雙百計(jì)劃”（編號(hào)：魯政辦字〔2017〕144號(hào)）;2020年度山東省重點(diǎn)扶持區(qū)域引進(jìn)急需緊缺人才項(xiàng)目（編號(hào)：泰發(fā)改區(qū)域〔2020〕352號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：齊素敏（1989—），女，山東沂源人，碩士，助理研究員，主要從事植物微生態(tài)制劑的研發(fā)工作。E-mail：qsm20095089@126.com。

木霉菌（Trichoderma spp.）屬半知菌亞門木霉屬，該類菌適應(yīng)力強(qiáng)，分布廣泛，是一類重要的生防真菌[1]，常見(jiàn)的木霉有綠色木霉（Trichoderma viride）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）、長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）等。據(jù)報(bào)道，木霉菌已成功用于防治番茄灰霉病[2]、番茄枯萎病[3]、黃瓜枯萎病[4]、花生根腐病[5]等植物病害，該類菌對(duì)植物病害起到防控作用的機(jī)制主要?dú)w結(jié)于競(jìng)爭(zhēng)[6]、誘導(dǎo)抗性[7-8]、重寄生[9]、抗生等。

哈茨木霉（T. harzianum）是一種常見(jiàn)的木霉菌，該菌對(duì)多種病原菌具有較強(qiáng)的抑制效果。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制率可達(dá)70.99%[10]。據(jù)報(bào)道，哈茨木霉對(duì)尖孢鐮刀菌、核盤(pán)菌、鏈格孢菌等植物病原菌具有明顯的拮抗作用[11]。Swehla等研究了哈茨木霉對(duì)芝麻莖點(diǎn)枯病菌的抑制效果，結(jié)果表明菌絲體生長(zhǎng)抑制率為76.96%[12]。有關(guān)哈茨木霉對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用，及哈茨木霉在草莓根系定殖能力及對(duì)草莓根腐病的防治效果的研究較少。本研究以哈茨木霉NBL-Z1菌株為試驗(yàn)材料，通過(guò)室內(nèi)拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)5種供試病原真菌均具有抑制效果，后研究NBL-Z1菌株在草莓根際的定殖能力，以及其對(duì)草莓根腐病的防治效果和促生作用，以期為防治草莓根腐病等土傳病害的生防菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

哈茨木霉NBL-Z1菌株于土壤中分離純化獲得。該菌株目前保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為CGMCC19602。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 菌株NBL-Z1無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌活性測(cè)定

將NBL-Z1菌株接種到PDB培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)120 h后，10 000 r/min離心，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾得無(wú)菌發(fā)酵濾液，按體積1 ∶9的比例將其與冷卻至50 ℃左右的滅菌PDA培養(yǎng)基混勻，倒入滅過(guò)菌的平皿中，待平皿冷凝后將直徑為9 mm的病原真菌菌餅置于平板中央，以普通PDA培養(yǎng)基平板為對(duì)照，于28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用十字交叉法分別于96、144 h測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算相對(duì)抑菌率。相對(duì)抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.3 菌株NBL-Z1在草莓根系定殖量的檢測(cè)

本試驗(yàn)于2019年12月在山東省泰安市寧陽(yáng)縣鄉(xiāng)飲鄉(xiāng)（116.80°E，35.77°N）巴夫生態(tài)大棚進(jìn)行。

將 NBL-Z1菌株于PDB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)120 h后，用4 層滅菌濾紙過(guò)濾，加無(wú)菌水制成分生孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)整濃度為1.0×107 CFU/mL。每株草莓灌根接種 10 mL 該菌孢子懸浮液。分別于接種NBL-Z1 菌株后1、7、14、21、28、35 d取樣進(jìn)行定殖量的檢測(cè)。切取草莓根組織，轉(zhuǎn)移至離心管中。向離心管中加入 1 mL 1×PBS 和玻璃珠若干，依次超聲振蕩 1 min，漩渦振蕩 1 min，冰浴 1 min，重復(fù) 3 次。將獲得的菌懸液梯度稀釋10～106倍，吸取 200 μL 菌懸液涂布于PDA培養(yǎng)基平板，于28 ℃培養(yǎng)120 h，記錄平板上的菌落數(shù)，計(jì)算菌株NBL-Z1 在草莓根系的定殖量。

1.4 菌株NBL-Z1的防病作用

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：對(duì)照（CK）、單接病原菌（P）、同時(shí)接種病原菌和NBL-Z1菌株（P+NBL-Z1）。每個(gè)處理重復(fù)20棵番茄。分別刮取PDA培養(yǎng)基平板上 28 ℃、培養(yǎng)120 h的尖孢鐮刀菌孢子和NBL-Z1菌株，分散到0.1%吐溫-80溶液中制成孢子懸液，調(diào)整病原菌和生防菌的濃度至1.0×107 CFU/mL。采取傷根灌注法[13]同時(shí)接種病原菌和生防菌，各菌株接種量均為每棵10 mL。接種50 d后挖取植株，統(tǒng)計(jì)發(fā)病程度，計(jì)算病情指數(shù)、防效，測(cè)定植株鮮質(zhì)量、單株產(chǎn)量及葉綠素含量（SPAD值）。

根腐病發(fā)病程度分為6級(jí)：0級(jí)為根系未發(fā)病;1級(jí)為根系發(fā)病率≤30%，葉片正常;2級(jí)為30%<根系發(fā)病率≤60%，葉片正常;3級(jí)為60%<根系發(fā)病率≤80%，葉片變黃;4級(jí)為根系發(fā)病率>80%，葉片枯萎;5級(jí)為整株死亡，葉片干枯[14]。

病情指數(shù)=[∑（各病級(jí)株數(shù)×各病級(jí)代表值）/（總株數(shù)×最高病級(jí)代表值）]× 100;

防效=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)× 100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行Duncans顯著性分析和Probit法回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株NBL-Z1對(duì)病原菌的抑制作用

從表1可以看出，NBL-Z1菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)5種病原真菌菌絲生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制作用。NBL-Z1菌株對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好，處理96、144 h，抑菌率均為100.00%（圖1）。處理96 h后，NBL-Z1菌株對(duì)鏈格孢的菌絲生長(zhǎng)抑菌率達(dá)94.61%（圖2），但對(duì)立枯絲核菌的抑菌率僅為49.17% 。培養(yǎng)144 h，NBL-Z1菌株對(duì)鏈格孢的菌絲生長(zhǎng)抑菌率為90.38%，對(duì)其他病原真菌的菌絲生長(zhǎng)抑菌率為56.52%～82.54%。總體來(lái)看，NBL-Z1 菌株對(duì)5種病原真菌96 h的拮抗效果優(yōu)于144 h。

2.2 菌株NBL-Z1在草莓根域的定殖

植物根際促生菌在植物根際定殖能力是影響其生防效果的重要原因之一，是發(fā)揮其有益功能的前提。為了檢測(cè)NBL-Z1菌株在草莓根表的定殖，在NBL-Z1菌株接種后的1、7、14、21、28、35 d采集根系樣品，分離并培養(yǎng)定殖于根表的NBL-Z1菌株，統(tǒng)計(jì)其定殖量。由圖3可知，接種后1 d，NBL-Z1菌株在草莓根表的定殖量為0.68×107 CFU/mL，隨著草莓的生長(zhǎng)，該菌株在草莓根表的定殖量逐漸增加，接種后28 d，NBL-Z1菌株的定殖量達(dá)到最大，為 8.10×107 CFU/mL。接種后35 d，NBL-Z1菌株的定殖量略微下降，為6.47×107 CFU/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，哈茨木霉菌能夠在草莓根際土壤中定殖和生長(zhǎng)繁殖，定殖量呈現(xiàn)先增加后降低的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。

2.3 NBL-Z1菌株對(duì)草莓防病促生的作用

由表2可知，接種NBL-Z1菌株可促進(jìn)接種根腐病原菌尖孢鐮刀菌的草莓生長(zhǎng)，提高其產(chǎn)量，降低根腐病發(fā)生率。與單接病原菌處理P相比，混合接種NBL-Z1菌株處理的草莓植株鮮質(zhì)量、單株產(chǎn)量分別增加28.17%、25.92%。接種NBL-Z1菌株

處理組草莓葉綠素含量顯著增加，較單接病原菌組增加27.89%。

以上結(jié)果表明，混合接種NBL-Z1菌株不僅能促進(jìn)草莓生長(zhǎng)發(fā)育，提高其光合指標(biāo)，還能有效降低草莓根腐病的發(fā)病率，防效為65.6%。

3 討論與結(jié)論

草莓根腐病是草莓生產(chǎn)中的一種主要病害，該病由多種土傳病原真菌復(fù)合侵染所致[15-16]，其中尖孢鐮刀菌是重要的病原菌之一[17]。近年來(lái)，利用微生物防治植物病蟲(chóng)害具有安全、環(huán)保、高效等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。陳哲等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌CM3菌株對(duì)尖孢鐮刀菌引起的草莓根腐病的防治效果達(dá)到了 64.86%[17]。王占武等的田間試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌B501菌株對(duì)草莓根腐病的防效高達(dá)94%[18];Kurze等研究發(fā)現(xiàn)，沙雷氏菌HRO-C48菌株可有效降低草莓根腐病的發(fā)生[19]。孫敬祖等研究報(bào)道，放線菌Act12菌劑對(duì)草莓根腐病的相對(duì)防效為84.7%[20]。除生防細(xì)菌和放線菌外，一些真菌如哈茨木霉[14，21]、鉤木霉[22]等木霉菌對(duì)草莓根腐病也具有良好效果。本研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉NBL-Z1菌株對(duì)尖孢鐮刀菌96 h的抑菌率可達(dá)100. 00%;NBL-Z1菌株能夠在草莓根際土壤中穩(wěn)定定殖，接種后28 d，在草莓根表定殖數(shù)量為8.10×107 CFU/g;在田間條件下，NBL-Z1菌株對(duì)草莓根腐病具有良好的防治效果，防效為65.6%。

大量研究表明，木霉菌能促進(jìn)植株生長(zhǎng)，改善植物營(yíng)養(yǎng)狀況[23-24]。郭成瑾等研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉處理的馬鈴薯株高、莖粗和分枝數(shù)均明顯高于對(duì)照[25]。Es-Soufi等研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉可以促進(jìn)植物發(fā)育并延長(zhǎng)其開(kāi)花和結(jié)果的持續(xù)時(shí)間[26]。李松鵬等研究報(bào)道，哈茨木霉發(fā)酵液有利于促進(jìn)種子發(fā)芽與生長(zhǎng)的作用[27]。本試驗(yàn)中，用哈茨木霉 NBL-Z1 無(wú)菌上清液澆灌草莓植株，發(fā)現(xiàn)處理組的草莓植株鮮質(zhì)量、單株產(chǎn)量和葉綠素含量分別增加28.17%、25.92%、27.89%。說(shuō)明哈茨木霉 NBL-Z1菌株能夠有效促進(jìn)草莓植株的生長(zhǎng)。

本研究結(jié)果表明，哈茨木霉NBL-Z1無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)5種供試病原真菌有較強(qiáng)的拮抗作用，處理后96、144 h，NBL-Z1菌株對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑菌率均為100. 00%;接種后28 d，NBL-Z菌株在草莓根表定殖數(shù)量最大，為8.10×107 CFU/g;菌株NBL-Z1對(duì)草莓根腐病的防效為65.6%，同時(shí)可促進(jìn)盆栽草莓植株生長(zhǎng)，提高果實(shí)產(chǎn)量。在接下來(lái)的研究中，我們將檢測(cè)NBL-Z1菌株對(duì)根系土壤中其他微生物的影響，并補(bǔ)充相應(yīng)的田間使用規(guī)范等。

哈茨木霉NBL-Z1菌株能有效防治草莓根腐病并促進(jìn)草莓植株生長(zhǎng)，具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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