廖嘉寶 胡艷楠 魏小涵 夏 婷 阮世發(fā) 王麗麗 譚曉梅#

1 華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司 廣東 廣州 518110

2 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東 廣州 510515

3 合肥華潤(rùn)三九醫(yī)藥有限公司 安徽 合肥 230041

本研究擬通過(guò)建立高效液相色譜法（HPLC）單一色譜條件，同時(shí)測(cè)定葛根芩連湯中四味藥的葛根素、大豆苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨7種成分含量的方法，探究以傳統(tǒng)湯劑或單味提取物合并的用藥方式對(duì)葛根芩連湯溶液及其沉淀中有效成分的影響。此外，建立HPLC指紋圖譜比較的方法，研究單味提取物合并液與傳統(tǒng)煎劑的溶液及其沉淀的指紋圖譜的差異，闡述葛根芩連湯單味提取物組方用藥的合理性，為葛根芩連湯相關(guān)制劑及其單味提取物組方用藥方式的質(zhì)量評(píng)價(jià)及臨床科學(xué)使用提供參考。

1 材料

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Agilent1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；真空冷凍干燥儀（德國(guó)LABCONCO公司）；萬(wàn)分之一天平（德國(guó)Sartorius）；十萬(wàn)分之一天平（德國(guó)Sartorius）。葛根芩連湯飲片組成：葛根、黃連、黃芩、炙甘草飲片各10批，分別制備單味提取物及傳統(tǒng)煎劑樣品，單味提取物合并組方所用飲片和合煎樣品相同。對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 含量測(cè)定方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備：分述如下。

2.1.1 葛根芩連湯傳統(tǒng)湯劑樣品制備：稱取葛根30g，黃連、黃芩各18g，炙甘草12g，葛根加水浸泡，先煎20min后加入余下3味煎煮，過(guò)濾后，藥渣加水2次煎煮，取濾液，合并水煎液，濃縮干燥，得傳統(tǒng)湯劑的凍干粉樣品（批號(hào)H1-10）。同法煎煮葛根芩連水煎液，離心，得10批傳統(tǒng)湯劑的沉淀樣品（批號(hào)HS1-10）。

2.1.2 葛根芩連湯單味提取物合并液樣品制備：稱取葛根加水浸泡，煎煮2次，合并水煎液；分別稱黃連、黃芩、甘草，水煎煮2次，分別得黃連、黃芩、甘草的水煎液。水煎液濃縮干燥，分別制得單味提取物合并液的凍干粉樣品（批號(hào)D1-10）。同法煎煮葛根芩連湯單味提取物，離心，得10批單煎合并沉淀樣品（批號(hào)DS1-10）。

2.2 含量測(cè)定色譜條件：以C18為色譜柱，柱溫25℃；以甲醇（A）-0.15%三氟乙酸（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，條件為 0～20min，23%～30%A；21～34min，35%～40%A；35～45min，42%～45%A；50～54min，60%～80%A；54～60min，80%～80%A；流速為 1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250nm；進(jìn)樣量為5μl。

2.3 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備：精密稱取葛根素、大豆苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨對(duì)照品適量，加80%甲醇制成混合對(duì)照品溶液。

2.4 含量測(cè)定供試品溶液的制備：取凍干粉約0.15g，或沉淀物0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，稱定質(zhì)量，超聲處理，用80%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，離心取上清，濾過(guò)即得供試品溶液。

2.5 含量測(cè)定方法學(xué)考察：按方法學(xué)考察要求開(kāi)展專屬性、線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、加樣回收及穩(wěn)定性試驗(yàn)，均符合要求，見(jiàn)圖1A-H。說(shuō)明該方法用于分析葛根芩連湯樣品含量測(cè)定準(zhǔn)確穩(wěn)定。

圖1 含量測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果

2.6 葛根芩連湯單味提取物合并液與傳統(tǒng)湯劑含量分析：按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖（圖2A），結(jié)果顯示在溶液中，相比于傳統(tǒng)合煎液，10批單煎合并液中葛根素的含量平均高113%，大豆苷平均高114%，鹽酸小檗堿平均高141%，鹽酸巴馬汀平均高129%，黃芩苷平均高119%，漢黃芩苷平均高116%，甘草酸銨平均高145%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B）。

2.7 葛根芩連湯單味提取物合并液與傳統(tǒng)湯劑中的沉淀物分析：按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖（圖2C）。相比于傳統(tǒng)合煎沉淀，10批單味提取物合并液沉淀中葛根素的含量平均低13%，大豆苷平均低10%，鹽酸小檗堿平均低17%，鹽酸巴馬汀平均低16%，黃芩苷平均低17%，漢黃芩苷平均低13%，甘草酸銨平均低11%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2D）。

3 指紋圖譜方法與結(jié)果

3.1 指紋圖譜色譜條件：以C18為色譜柱；以0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，條件為0～40min，90%～60%A；40～45min，60%～55%A；波長(zhǎng)為275nm，柱溫為25℃。

3.2 指紋圖譜對(duì)照品溶液制備：取3-OH葛根素、葛根素、大豆苷、甘草苷、染料木苷、藥根堿、黃芩苷（S峰）、巴馬汀、小檗堿、漢黃芩苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制對(duì)照品參照物溶液。

3.3 系統(tǒng)方法學(xué)考察：按系統(tǒng)方法學(xué)要求進(jìn)行試驗(yàn)，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性中16個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD%小于3.0%，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，相似度均在0.999以上。說(shuō)明該方法用于分析葛根芩連湯樣品指紋圖譜準(zhǔn)確穩(wěn)定。

3.4 葛根芩連湯單味提取物合并液與傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜比較：按3.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，供試品色譜中應(yīng)呈現(xiàn)16個(gè)特征峰，其中1、2、5、6、7、9、11、12、13、15、16號(hào)峰的保留時(shí)間應(yīng)分別與3OH-葛根素、葛根素、大豆苷、甘草苷、染料木苷、藥根堿、黃芩苷、巴馬汀、小檗堿、漢黃芩苷、甘草酸銨對(duì)照品參照物峰的保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)；以黃芩苷參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±8%之內(nèi)，規(guī)定值為0.32(峰1)、0.42(峰 2)、0.43(峰3)、0.44(峰4)、0.54(峰 5)、0.69(峰 6)、0.73(峰 7)、0.88(峰 8)、0.89(峰 9)、0.91(峰10)、1.00(峰11，黃芩苷，S峰)、1.03(峰 12)、1.06(峰13)、1.14(峰14)、1.21(峰15)、1.55(峰16)。按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)計(jì)算葛根芩連湯單味提取物合并液（圖3B）、傳統(tǒng)湯劑的凍干粉對(duì)照指紋圖譜（圖3A）的多批供試品指紋圖譜相似度達(dá)0.999，表明該方法能用于葛根芩連湯水煎液樣品的指紋圖譜鑒別分析。

按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)計(jì)算生成10批葛根芩連湯單味提取物合并液、傳統(tǒng)湯液的凍干粉的對(duì)照指紋圖譜并進(jìn)行比較（圖3C），設(shè)傳統(tǒng)合湯液的指紋圖譜為對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果顯示兩者指紋圖譜相似度高達(dá)0.999，表明葛根芩連湯應(yīng)用不同煎煮方式入藥對(duì)其水煎液的物質(zhì)組成類型無(wú)顯著差異，但峰面積差異明顯。

3.5 葛根芩連湯傳統(tǒng)湯劑沉淀與單味提取物合并液沉淀的比較：按3.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)計(jì)算，并生成10批單味提取物合并液沉淀（圖3D）和10批傳統(tǒng)湯劑沉淀對(duì)照指紋圖譜（圖3E）。結(jié)果顯示，10批葛根芩連湯單味提取物合并液沉淀和10批傳統(tǒng)湯劑沉淀供試品相對(duì)保留時(shí)間及相似度均在要求范圍內(nèi)。將10批葛根芩連湯傳統(tǒng)湯劑液沉淀與單味提取物合并液沉淀樣品各自生成的特征指紋圖譜進(jìn)行比較（圖3F），相似度為1.000，10批葛根芩連湯傳統(tǒng)湯劑液沉淀與單味提取物合并液沉淀樣品共有峰的出峰時(shí)間一致，指紋圖譜相似，但是峰面積相差較大。

圖3 葛根芩連湯水煎液凍干粉與沉淀物指紋圖譜

4 討論

本研究同時(shí)測(cè)定葛根芩連湯中4味藥的7種有效成分含量，成分類別包括異黃酮、黃酮、生物堿和皂苷類，有效成分具有代表性，方法簡(jiǎn)單便捷，可用于評(píng)價(jià)不同工藝對(duì)其主要化學(xué)成分的影響。所建立的指紋圖譜分析方法能準(zhǔn)確標(biāo)識(shí)葛根芩連湯中16個(gè)共有峰，明確了其物質(zhì)基礎(chǔ)組成特征。

傳統(tǒng)飲片的煎煮由于個(gè)人習(xí)慣、火候掌握等客觀因素的影響，含量差異較大，而單味提取物煎煮工藝及含量相對(duì)穩(wěn)定，使用方便，含量較高。有學(xué)者從中藥單味提取物研究入手，對(duì)中藥單煎與合煎的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，造成二者成分差異的機(jī)制可能與助溶效應(yīng)、沉淀效應(yīng)、改變?nèi)軇┤芙馓匦浴⒏淖內(nèi)芤簆H值、相互反應(yīng)生成溶解度不同的新成分有關(guān)，其影響因素包括藥物不同配比、煎煮時(shí)間、加水量與藥物的比例及炮制對(duì)中藥成分溶出率的作用、單煎液混合時(shí)的相互反應(yīng)等。

對(duì)10批葛根芩連湯單味提取物合并液與傳統(tǒng)湯劑的指紋圖譜研究，對(duì)于標(biāo)定的16個(gè)特征色譜峰，其相對(duì)保留時(shí)間在要求范圍內(nèi)，溶液之間的相似度為0.999，沉淀之間的相似度為1.000，兩者的色譜圖基本一致，單味提取物合并液仍能保留傳統(tǒng)湯劑的化學(xué)特性及沉淀特征。單味提取物合并液的7種藥效成分含量均高于傳統(tǒng)湯劑，表明在葛根芩連湯的復(fù)方中單味藥材煎煮的方式較傳統(tǒng)湯劑更有利于有效成分的溶出，避免了煎煮過(guò)程中各要藥味成分的相互作用。研究還發(fā)現(xiàn)，由于藥味中的化學(xué)成分的酸堿特征，葛根芩連湯傳統(tǒng)湯劑與單味提取物合并液放冷后均有淺黃色絮狀沉淀生成，沉淀重量之間無(wú)明顯差異，但單味提取物合并液沉淀中7個(gè)有效成分含量小于傳統(tǒng)湯劑沉淀，約為傳統(tǒng)湯劑沉淀的8%～20%，傳統(tǒng)合煎工藝可能導(dǎo)致指標(biāo)成分更多地從上清液轉(zhuǎn)移到沉淀，單煎合并的煎煮方式能有效減少有效成分在沉淀中的分布，使其更多地留存在上清液中。已有研究表明，沉淀產(chǎn)生的原因可能是葛根中呈酸性的異黃酮類成分與黃連中呈堿性的生物堿成分相互反應(yīng)，形成絡(luò)合物進(jìn)而沉淀有關(guān)，傳統(tǒng)合煎成分相互作用時(shí)間長(zhǎng)，沉淀中的有效成分多于單煎合并液。而從沉淀物的指紋圖譜及特征圖譜分析結(jié)果看，葛根芩連湯沉淀中同樣存在著一定量的活性成分。本研究顯示單味提取物組方入藥的方式減少了有效成分往沉淀物中轉(zhuǎn)移，提高了藥液中有效成分含量，有利于活性成分快速吸收。

臨床上，中藥復(fù)方用藥形式多樣，與傳統(tǒng)的煎煮方式相比，以單味提取物組方形式入藥的中藥配方顆粒常受到質(zhì)疑，而依據(jù)中醫(yī)辨證、君臣佐使配伍用藥為中醫(yī)方劑的根本要義，中藥配方顆粒組方用藥并不違背配伍組方原則。此外，單味提取物組方入藥備受爭(zhēng)議的另一因素是傳統(tǒng)煎劑中共煎產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì)，而本指紋圖譜結(jié)果研究表明葛根芩連方通過(guò)單味藥煎煮后以提取物合并組方與傳統(tǒng)煎劑的有效物質(zhì)相似度高，反映出葛根芩連湯中藥配方顆粒組方與傳統(tǒng)煎劑的物質(zhì)組成的一致性。研究還表明葛根芩連湯單味提取物組方能減少有效成分往沉淀中轉(zhuǎn)移，利于葛根芩連湯功效成分體內(nèi)快速吸收。本研究為葛根芩連湯各藥味的單味提取物組方用法提供了臨床應(yīng)用參考，還為葛根芩連方其配方顆粒制劑研究提供了工藝指導(dǎo)。