倪偉海 （寧波市鎮(zhèn)海中學 浙江寧波 315299）

在高中生物學教學中，“檢測生物組織中的糖類”是一個經(jīng)典且重要的實驗。在2019 版人教版教材中，該實驗所用檢測試劑為斐林試劑。在2019 版浙科版教材中則使用本尼迪特試劑（也稱為班氏試劑）。斐林試劑是由0.1 g/mL NaOH 和0.05 g/mL CuSO4配制而成。其中0.1 g/mL NaOH 溶液稱為斐林試劑甲液，0.05 g/mL CuSO4稱為斐林試劑乙液。本尼迪特試劑的配制方法為：將4.3 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解在50 mL 水中，加熱使之溶解，冷卻后加水至40 mL；另將43 g 檸檬酸鈉和25 g 無水碳酸鈉溶解于150 mL 水中，加熱使之溶解。冷卻后將上述2 份溶液混合，用水稀釋至250 mL，當溶液不澄清時可過濾。本尼迪特試劑常被認為是斐林試劑的改良試劑，避免了斐林試劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用的缺點，可長期保存。斐林試劑在儲存上具有缺點，而人教版仍選擇其作為檢測試劑是否存在其他原因？斐林試劑在其他方面，例如，檢測速度和靈敏度等是否具有優(yōu)勢？

1 研究背景

斐林試劑和本尼迪特試劑反應原理具有一定共性：都是利用Cu（OH）2與還原性糖的醛基在加熱條件下反應，生成磚紅色的Cu2O 沉淀以檢測還原性糖的存在。但二者產(chǎn)生Cu（OH）2的方式存在差別。斐林試劑的甲液與乙液直接反應產(chǎn)生Cu（OH）2，Cu（OH）2再與還原性糖反應產(chǎn)生磚紅色沉淀。而本尼迪特試劑中Cu（OH）2的產(chǎn)生過程是：檸檬酸鈉和碳酸鈉均是強堿弱酸鹽，在水中水解產(chǎn)生OH-，與CuSO4溶液混合時，生成的Cu（OH）2與還原性糖反應生成磚紅色沉淀。從原理分析，斐林試劑甲液與乙液強烈反應產(chǎn)生Cu（OH）2，Cu（OH）2很容易沉淀，濃度相對較高。因此，可推測其檢測還原性糖的靈敏度較高。而本尼迪特試劑利用檸檬酸鈉和碳酸鈉水解產(chǎn)生OH-，與CuSO4混合后產(chǎn)生的Cu（OH）2。因為水解產(chǎn)生的OH-數(shù)量較少，產(chǎn)生的Cu（OH）2濃度也相對較低。雖可長期保存，但據(jù)此可推測本尼迪特試劑檢測還原性糖的靈敏度較低。

斐林試劑和本尼迪特試劑與葡萄糖反應時，?？梢婎伾珡乃{色到磚紅色的變化過程。當反應體系擴大至400 mL 時，可清楚地觀察到整個顏色變化過程：藍色、藍綠色、綠色、淺綠色、黃綠色、黃色、橙黃色、橙色、橙紅色、磚紅色、棕黑色[1]。綠色是黃色和藍色等量混合，橙色是黃色和紅色等量混合，因而該反應會發(fā)生這種顏色依次變化的過程。因此，可通過觀察不同濃度的葡萄糖標準液的顏色變化檢測試劑靈敏度[2]。

2 材料與方法

2.1 實驗材料 斐林試劑甲液：0.1 g/mL NaOH、斐林試劑乙液：0.05 g/mL CuSO4、本尼迪特試劑、不同濃度的葡萄糖標準液（分別為0 g/L、1 g/L、5 g/L、8 g/L、10 g/L、13 g/L、16 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）、電子天平、燒杯、試管、試管架、恒溫水浴鍋、一次性手套、移液器。

2.2 實驗步驟 取20 支試管，均分為2 組（斐林試劑組和本尼迪特試劑組），各組每支分別依次編號為1～10。依次向每支試管注入3 mL 葡萄糖標準液（分別為0 g/L、1 g/L、5 g/L、8 g/L、10 g/L、13 g/L、16 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）。斐林試劑組每支試管分別注入3 mL 斐林試劑（甲液和乙液等量混合均勻后再注入），本尼迪特試劑組每支試管分別注入3 mL 本尼迪特試劑。將20 支試管置于盛有60℃的恒溫水浴鍋中加熱1 min、5 min 和20 min。觀察試管中出現(xiàn)的顏色變化。

3 實驗結果與討論

3.1 斐林試劑與本尼迪特試劑中Cu（OH）2含量比較 葡萄糖標準液分別加入斐林試劑和本尼迪特試劑時顏色如圖1。觀察圖1 發(fā)現(xiàn)，斐林試劑組的藍色顯著比本尼迪特試劑組的要深。仔細觀察，斐林試劑組內(nèi)存在藍色絮狀沉淀（圖2），本尼迪特試劑組均澄清。這表明斐林試劑產(chǎn)生的Cu（OH）2濃度相對較高，析出沉淀，而本尼迪特組的Cu（OH）2濃度相對較低。

圖1 葡萄糖標準液分別加入斐林試劑和本尼迪特試劑顏色變化

圖2 斐林試劑

3.2 斐林試劑與本尼迪特試劑對葡萄糖檢測速度比較 葡萄糖標準液60 ℃熱水浴1 min 和5 min 時顏色變化見圖3 和圖4。從圖3 中可知，熱水浴加熱1 min 后，斐林試劑組的30 g/L 葡萄糖標準液呈現(xiàn)黃綠色，25 g/L 葡萄糖標準液呈現(xiàn)藍綠色，而本尼迪特試劑組均未發(fā)生明顯顏色變化。從圖4 中可知，熱水浴加熱5 min 后，本尼迪特試劑組30 g/L 葡萄糖標準液上層呈現(xiàn)輕微黃綠色時，斐林試劑組的30 g/L、25 g/L、20 g/L、16 g/L、13 g/L 葡萄糖標準液均出現(xiàn)了磚紅色沉淀。這表明斐林試劑與相同濃度的葡萄糖標準液反應時，產(chǎn)生磚紅色沉淀的速度更快，現(xiàn)象更明顯。

圖3 熱水浴1 min 葡萄糖標準液顏色變化

圖4 熱水浴5 min 葡萄糖標準液顏色變化

3.3 斐林試劑和本尼迪特試劑對葡萄糖檢測靈敏度比較 葡萄糖標準液60 ℃熱水浴1 min 和5 min 時顏色變化見圖3 和圖4。仔細觀察5 min后各支試管的顏色變化，發(fā)現(xiàn)從20 min 開始，各支試管的顏色均不再發(fā)生可見的變化（圖5）。因此，可近似的認為Cu（OH）2與葡萄糖的醛基反應完全。分析圖5 可知，本尼迪特試劑組的13 g/L、16 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L 組出現(xiàn)明顯的磚紅色沉淀，而斐林試劑組的5 g/L、8 g/L、10 g/L、13 g/L、16 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L 組均出現(xiàn)明顯的磚紅色沉淀。分析可知，相較于本尼迪特試劑，斐林試劑可檢測含低濃度葡萄糖的溶液。

圖5 熱水浴20 min 葡萄糖標準液顏色變化

實驗結果表明：斐林試劑檢測還原性糖時，其產(chǎn)生磚紅色沉淀的速度快于本尼迪特試劑，檢測還原性糖的靈敏度也高于本尼迪特試劑。就檢測還原性糖的效果，斐林試劑要好于本尼迪特試劑。這是因為斐林試劑中的Cu（OH）2濃度相對本尼迪特試劑較高，因此，能更快更多地與還原必須現(xiàn)配現(xiàn)用，實際生活中通常用于研究或針對個別病人的檢驗。而本尼迪特試劑可長期保存，在實際中通常用于生產(chǎn)和大多數(shù)病人的檢驗。