許旭雯 虞 馳

（浙江省寧波市第四中學(xué) 浙江寧波 315016）

染色體的數(shù)目變化會(huì)引起生物性狀的變異，在自然和人工條件下均能誘發(fā)植物細(xì)胞染色體數(shù)目的變異，借此所得到的多倍體或非整倍體植物對(duì)于作物遺傳育種、擴(kuò)大種質(zhì)資源、培育新種等具有重要意義[1]?；瘜W(xué)誘變是最常用的人工誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體增加的方法，常用的化學(xué)誘變劑包括秋水仙素、細(xì)胞松弛素B 等；而某些環(huán)境因素也會(huì)引起植物細(xì)胞染色體數(shù)目的變化，例如，在人教版高中生物學(xué)必修2 的第5 章“基因突變及其他變異”中，設(shè)置了“低溫誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體數(shù)目變化”的探究實(shí)踐活動(dòng)[2]。

不同濃度的秋水仙素對(duì)于不同植物細(xì)胞染色體數(shù)目的誘導(dǎo)效果各有差異；引起染色體數(shù)目變異的不同誘導(dǎo)手段的作用機(jī)制不甚相同，其所產(chǎn)生的效果也不相同。低溫誘導(dǎo)染色體數(shù)量增加的效率較低，對(duì)高中生而言，實(shí)驗(yàn)操作難度大，實(shí)驗(yàn)成功率不高[3]?；诖耍疚闹荚诒容^不同濃度秋水仙素處理下對(duì)同種植物細(xì)胞染色體數(shù)量增加效果的差異，驗(yàn)證低溫誘導(dǎo)染色體數(shù)目變化實(shí)驗(yàn)的有效性與可操作性，探究低溫和秋水仙素共同誘導(dǎo)下植物細(xì)胞染色體數(shù)目變化的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

1）材料：大蒜（Allium sativum L.，2n=16）。

2）器具：培養(yǎng)皿、濾紙、紗布、燒杯、鑷子、剪刀、顯微鏡、牙簽、載玻片、蓋玻片、電子天平、稱(chēng)量紙、藥匙、溫度計(jì)、螺旋測(cè)微儀、4℃冰箱。

3）試劑：秋水仙素（沃凱生物，1 g）、卡諾氏液（海標(biāo)科技，250 mL）、蒸餾水、質(zhì)量濃度為0.01 g/mL的甲紫（龍膽紫）溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的鹽酸溶液、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液[4-5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料的處理 將大蒜置于裝滿清水的容器上方，使大蒜的底部接觸水面，在室溫（25℃）條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待其萌發(fā)出一定量的不定根后再進(jìn)行誘導(dǎo)處理。隔天更換清水以保證水質(zhì)干凈，防止腐爛。

1.2.2 植物根尖的培養(yǎng) 用電子天平稱(chēng)取定量的秋水仙素粉末，配制成不同濃度的秋水仙素培養(yǎng)液：0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.10%。將萌發(fā)出不定根的大蒜隨機(jī)分成等量且生長(zhǎng)情況相同的14 組，分別用牙簽固定于裝有相應(yīng)培養(yǎng)液的小燒杯中，使大蒜底部接觸液面，對(duì)應(yīng)地將整個(gè)裝置置于室溫（25℃）與低溫（4℃）條件進(jìn)行培養(yǎng)，不同組別實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置見(jiàn)表1。不同處理組別中含多個(gè)大蒜樣本。

表1 雙因子實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置表

1.2.3 根尖生長(zhǎng)情況觀察 植物細(xì)胞的有絲分裂具有日周期性，通常中午細(xì)胞分裂較旺盛，因此，在細(xì)胞分裂高峰期取材，有利于獲得較好的觀察結(jié)果。將各誘導(dǎo)處理組中的若干大蒜樣本從燒杯中取下，并拍照記錄。測(cè)定各組大蒜根尖0.1 cm 處的直徑，每組至少20 次，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 分裂細(xì)胞的染色體觀察 剪取誘導(dǎo)處理后的各組若干大蒜樣本根尖處約0.5 cm 的組織，置于卡諾氏液中浸泡0.5 h，以固定細(xì)胞形態(tài)，然后用體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精沖洗2 次，并制作臨時(shí)裝片。將組織置于盛有解離液（鹽酸和酒精1∶1 體積比的混合液）的玻璃皿中，在室溫下解離3～5 min。待根尖軟化后，用鑷子取出，并置于盛有清水的玻璃皿中漂洗10 min。再將根尖浸入龍膽紫溶液中染色3～5 min 后，用鑷子取出，置于載玻片上，蓋上蓋玻片。用橡皮輕輕敲打蓋玻片，使細(xì)胞分散開(kāi)。將制成的裝片先置于低倍鏡下觀察，尋找染色體形態(tài)較好的分裂相，用高倍鏡觀察并拍照。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的秋水仙素對(duì)大蒜根尖生長(zhǎng)狀況的影響 在室溫（25℃）條件下，設(shè)置8 組不同濃度的秋水仙素培養(yǎng)液（0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.10%），分別處理大蒜的根尖約36 h，記錄大蒜的不定根生長(zhǎng)情況（圖1）。由于室溫條件下各處理組中若干大蒜樣本的根尖生長(zhǎng)狀況趨勢(shì)一致，因此，從各組中隨機(jī)選取1 個(gè)樣本以說(shuō)明情況。在室溫下，隨著秋水仙素濃度的提高，根長(zhǎng)顯著變短。與空白對(duì)照組相比，加入秋水仙素處理的實(shí)驗(yàn)組在根尖處出現(xiàn)不同程度的膨大現(xiàn)象。測(cè)定各組大蒜根尖直徑，每組取樣20 次，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析各組根尖的直徑表明：隨秋水仙素濃度的提高，大蒜根尖處的直徑不斷增大，膨大現(xiàn)象逐漸明顯（表2）。

圖1 室溫（25℃）條件下不同濃度秋水仙素溶液培養(yǎng)36 h 后大蒜不定根的生長(zhǎng)狀況（標(biāo)尺為1 cm）

表2 室溫（25℃）條件下不同濃度秋水仙素溶液培養(yǎng)的大蒜根尖分生區(qū)直徑（n=20，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

2.2 低溫與不同濃度的秋水仙素共同作用對(duì)大蒜的根尖生長(zhǎng)狀況的影響 在低溫（4℃）條件下，設(shè)置6 組不同濃度的秋水仙素培養(yǎng)液（0、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%），分別處理大蒜的根尖約72 h，記錄大蒜的不定根生長(zhǎng)情況（圖2）。由于低溫條件下各處理組中大蒜樣本的根尖生長(zhǎng)狀況趨勢(shì)一致，因此，從各組中隨機(jī)選取1 個(gè)樣本以說(shuō)明情況。與室溫條件下生長(zhǎng)的大蒜根尖相比，在低溫條件下生長(zhǎng)的不定根生長(zhǎng)速度明顯減慢，持續(xù)培養(yǎng)72 h 才能達(dá)到在室溫下培養(yǎng)36 h的根長(zhǎng)。隨著秋水仙素濃度的提高，不定根的根長(zhǎng)同樣顯著變短。與空白對(duì)照組相比，加入秋水仙素的實(shí)驗(yàn)組在根尖處出現(xiàn)了不同程度的膨大現(xiàn)象，但與室溫條件下相同秋水仙素濃度的實(shí)驗(yàn)組相比，膨大程度顯著減輕。測(cè)定各組大蒜根尖直徑，每組取樣20 次，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析各組根尖的直徑表明：僅低溫條件即會(huì)造成植物根尖的略微膨大，但當(dāng)與秋水仙素共同作用時(shí)，根尖膨大程度不及秋水仙素單因子實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)象明顯（表3）。

圖2 低溫（4℃）條件下不同濃度秋水仙素溶液培養(yǎng)72 h 后大蒜不定根的生長(zhǎng)狀況（標(biāo)尺為1 cm）

表3 低溫（4℃）條件下不同濃度秋水仙素溶液培養(yǎng)的大蒜根尖分生區(qū)直徑（n=20，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

2.3 不同濃度的秋水仙素對(duì)大蒜根尖分生區(qū)細(xì)胞染色體數(shù)目變化的影響 在室溫（25℃）條件下，觀察不同濃度的秋水仙素培養(yǎng)液處理下的大蒜根尖分生區(qū)的有絲分裂細(xì)胞，分別記錄各實(shí)驗(yàn)組在分裂間期、有絲分裂前期、中期、后期和末期的染色體數(shù)目變化的情況（圖3）。在室溫條件下，隨著秋水仙素濃度的提高，大蒜根尖分生區(qū)進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞比例升高，分裂細(xì)胞內(nèi)染色體的數(shù)量明顯增加。其中，當(dāng)秋水仙素濃度為0.01%時(shí)，分裂細(xì)胞內(nèi)染色體的數(shù)量與清水組的區(qū)別不大；當(dāng)秋水仙素濃度大于0.05%時(shí)，分裂細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)量的增加極為明顯。

圖3 室溫（25℃）條件下不同濃度秋水仙素處理的分裂細(xì)胞中染色體數(shù)目變化情況（標(biāo)尺為50 μm）

2.4 低溫與不同濃度的秋水仙素共同作用對(duì)大蒜根尖分生區(qū)細(xì)胞染色體數(shù)目變化的影響 在低溫（4℃）條件下，觀察不同濃度的秋水仙素培養(yǎng)液處理下的大蒜根尖分生區(qū)的有絲分裂細(xì)胞，分別記錄各組在各個(gè)分裂時(shí)期的染色體數(shù)目變化的情況（圖4）。與室溫條件下不添加秋水仙素的對(duì)照組進(jìn)行比較，在低溫誘導(dǎo)時(shí)，大蒜根尖分生區(qū)分裂細(xì)胞中的染色體數(shù)明顯增加。值得注意的是，相較于秋水仙素單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果，低溫與不同濃度的秋水仙素共同作用時(shí)，誘導(dǎo)分裂細(xì)胞的染色體數(shù)目增加的效果沒(méi)有出現(xiàn)疊加，且隨著秋水仙素濃度的提高這種數(shù)目增加的效果反而被明顯削弱了。

圖4 低溫（4℃）條件下不同濃度秋水仙素處理的分裂細(xì)胞中染色體數(shù)目變化情況（標(biāo)尺為50 μm）

3 討論

低溫、秋水仙素單因子實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，低溫和秋水仙素均能誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體數(shù)目增加，使大蒜根尖分生區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增多，導(dǎo)致該區(qū)域出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的膨大現(xiàn)象。隨著秋水仙素處理濃度的提高，染色體數(shù)量增加的程度及根尖膨大程度均顯著提高，但低溫條件下植物細(xì)胞生長(zhǎng)分裂的速度放緩。

雙因子實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，低溫和秋水仙素共同誘導(dǎo)染色體數(shù)量增加的效果比秋水仙素單因子誘導(dǎo)增加的效果顯著減弱。秋水仙素誘導(dǎo)染色體數(shù)目增加的作用機(jī)制主要是構(gòu)成紡錘絲微管的微管蛋白上具有秋水仙素的親和位點(diǎn)，當(dāng)秋水仙素與之結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，便阻止了微管蛋白的繼續(xù)聚合；且秋水仙素可促使微管蛋白解聚，改變微管組裝和去組裝之間的平衡，抑制紡錘體的形成[6]。此時(shí)，低溫會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)微管蛋白或某些酶構(gòu)型的改變，從而抑制微管蛋白聚合形成紡錘絲；且低溫不利于細(xì)胞內(nèi)各項(xiàng)酶促反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞分裂時(shí)ATP 的供應(yīng)受阻，已完成染色體數(shù)目增加細(xì)胞的分裂活動(dòng)被抑制[7-8]。秋水仙素在紡錘絲微管形成過(guò)程中起破壞作用，而低溫條件下細(xì)胞的代謝活動(dòng)減緩，紡錘體組裝所需的能量與原料減少，即便添加秋水仙素也難以增強(qiáng)染色體數(shù)目增加的現(xiàn)象。

低溫確實(shí)能在一定程度上誘導(dǎo)大蒜根尖分生區(qū)細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目的增加，且低溫條件較易統(tǒng)一控制，實(shí)驗(yàn)成本較低，因此，教材中的實(shí)踐探究也利用該處理辦法誘導(dǎo)染色體數(shù)目變化。但低溫處理后大蒜不定根的生長(zhǎng)速率減緩，細(xì)胞分裂能力減弱，所以，在實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作過(guò)程中也常存在成功率不高、分裂相細(xì)胞量少等缺點(diǎn)。

秋水仙素作為一種化學(xué)誘變劑，其使用安全問(wèn)題仍難克服，因此，常建議采用低溫誘導(dǎo)的方法。但秋水仙素誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體數(shù)目增加的效率極高，能有效地提高實(shí)驗(yàn)效率和成功率，若能注意使用安全，則能很好推廣。本文研究結(jié)果顯示，不同濃度的秋水仙素（0～0.1%）誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體數(shù)目變化的效果具有明顯差異。當(dāng)培養(yǎng)液中秋水仙素濃度過(guò)高時(shí)，細(xì)胞中的染色體數(shù)目增加過(guò)度，造成不必要的試劑損耗，同時(shí)由此導(dǎo)致的根尖膨大過(guò)度也會(huì)造成制片的困難。本實(shí)驗(yàn)中分裂細(xì)胞染色體觀察結(jié)果表明，秋水仙素處理濃度控制在0.02%～0.03%為宜，此濃度下既能有效地觀察到染色體數(shù)目增加的現(xiàn)象，又易于制作臨時(shí)裝片，實(shí)驗(yàn)成功率較高。