益腎泄?jié)岱綄Ω咛黔h(huán)境下人腎小球內皮細胞的保護作用及機制*

王憲赟，黃芳，張小鹿，王怡

上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200437

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的三大微血管并發(fā)癥之一，是導致終末期腎病的主要原因之一，目前尚無有效方法干預其進展。研究證實，腎小球內皮細胞損傷在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1］。腎小球內皮細胞結構比較特殊，與一般的毛細血管內皮細胞不同，它具有特殊的窗孔、基底膜和糖萼。作為腎小球濾過屏障的一個關鍵組成部分，腎小球內皮細胞承載著更高的血流壓力，因此更容易受到損傷；其次，腎小球內皮細胞與系膜細胞和基底膜緊密相連，因此腎小球內皮細胞的損傷可能引起系膜細胞的病變［2］。

我科前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠微血栓形成與纖維蛋白原樣蛋白2（fibrinogen－like protein2，fgl2）凝血酶原酶mRNA高表達有關，益腎泄?jié)岱娇赏ㄟ^降低DN大鼠腎臟局部Fgl2凝血酶原酶，改善腎臟微循環(huán)，有效控制血肌酐水平。該方是本科長期應用治療慢性腎衰的經驗方，對原發(fā)病是糖尿病的患者療效更佳。既往研究證實，糖尿病大鼠腎小球內皮細胞可見fgl2凝血酶原酶的陽性表達，且與腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）密切相關［3］。因此，本研究選擇高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人腎小球內皮細胞，用不同濃度益腎泄?jié)岱胶幯甯深A，通過檢測干預前后腎小球內皮細胞的增殖情況、TNF－αmRNA、fgl2凝血酶原酶mRNA等指標，觀察益腎泄?jié)岱綄Ω咛黔h(huán)境下內皮細胞的保護作用及相關機制，并探討腎小球內皮細胞免疫凝血機制，證實微型癥積是導致DN內皮損傷的關鍵環(huán)節(jié)，為DN的中西醫(yī)結合治療提供更多理論依據。

1 材料

1.1 實驗細胞與動物人腎小球內皮細胞（human renal glomerular endothelial cells，HRGECs）（美國ScienCell研究實驗室，目錄號：4000）。SPF級雄性SD大鼠20只，體質量（200±15）g，購自上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證編號：SYXK（滬）2016－0004，實驗前適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑益腎泄?jié)岱筋w粒劑（黃芪20 g，生地黃10 g，淫羊藿10 g，太子參10 g，酒黃精10 g，紅花12 g，燙水蛭6 g，熟大黃12 g，江陰天江藥業(yè)有限公司，批號：1603028、1604121、1603134、1603038、1602113、1602110、1510136、1512126）。D－葡萄糖（上海生工生物工程有限公司，貨號：55－99－7）；內皮細胞培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM，美國ScienCell研究實驗室，貨號：1001）；胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：16000－044）；CCK－8試劑盒（美國Signalway Antibody公司，貨號：CP002）；SYBR Green PCR試劑盒、Trizol試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：K0223、1596－026）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，貨號：T1300－100）；逆轉錄試劑盒（加拿大Fermentas公司，貨號：K1622）；RMPI－1640培養(yǎng)液（美國Hyclone公司，貨號：SH30809.01B）；TNF－α、fgl2凝血酶原酶ELISA試劑盒（中國X－Y生物技術公司，貨號：B1120、B17641）。

1.3 儀器XDS－500C型顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）；CKX41／SF型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；DNM－9602型酶標儀（北京普朗新技術有限公司）；Thermo Forma 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱、ABI－7300型熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；MDF－U71V型超低溫冰箱（日本SANYO公司）。

2 方法

2.1 益腎泄?jié)岱胶幯宓闹苽鋵?0只健康雄性SD大鼠按照體質量排序，采用隨機數據表分為空白組和藥物組，每組10只。中藥顆粒劑的給藥劑量以60 kg成人藥量的20倍計算，給藥體積為10 mL·kg－1，即藥物濃度為3 g·mL－1，冷藏備用。藥物組以益腎泄?jié)岱焦辔?，空白組給予等體積的蒸餾水灌胃，早、晚各1次，灌胃3 d。末次灌胃前禁食不禁水2 h，灌胃1 h后大鼠腹主動脈取血，分離血清，過濾除菌，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)與分組HRGECs用含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長至80%～90%融合后，進行傳代培養(yǎng)。棄上清液，加入0.25%胰蛋白酶1 mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化3 min，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。當細胞質回縮、細胞間隙增大時，棄去消化液，加入新鮮培養(yǎng)液6 mL，用吸管吸取培養(yǎng)皿內培養(yǎng)液，反復輕柔吹打皿壁細胞，至細胞懸浮，將懸液分至2個培養(yǎng)皿，補足培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗使用傳代3代的細胞，當細胞處于對數生長期時，分為空白組、模型組、空白血清對照組、益腎泄?jié)岱胶幯宓蛣┝拷M、益腎泄?jié)岱胶幯甯邉┝拷M。除空白組外，其余4組給予含30 mmol·L－1D－葡萄糖的ECM培養(yǎng)基高糖誘導2 h后，空白血清對照組、益腎泄?jié)岱胶幯宓蛣┝拷M、益腎泄?jié)岱胶幯甯邉┝拷M分別加入10%空白血清、10%益腎泄?jié)岱胶幯濉?0%益腎泄?jié)岱胶幯?，培養(yǎng)24 h、48 h后進行相應檢測。

2.3 細胞增殖檢測將處于對數生長期的細胞經胰蛋白酶消化后，調整細胞密度為（1～5）×104mL－1。分別取100μL至96孔培養(yǎng)板中，設置3個復孔，以100μL培養(yǎng)液做空白對照，37℃培養(yǎng)過夜。各組細胞干預培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加入100μL CCK－8溶液（CCK－8與無血清培養(yǎng)基的體積比為1∶10），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。用酶標儀測定450nm波長處的吸光度，并記錄OD值。實驗重復3次。

2.4 ELISA法檢測HRGECs上清中TNF－α、fgl2凝血酶原酶的水平HRGECs培養(yǎng)24 h及48 h后，轉移至無菌管中，離心20 min左右（3 000 r·min－1，離心半徑：6 cm），收集細胞上清。嚴格按照試劑盒操作說明書操作，進行稀釋加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止，最后以空白孔調零，450 nm波長處測量各孔的吸光度（OD值），測定應在加終止液后15 min以內進行。實驗重復3次。

2.5 RT－PCR檢測HRGECs中TNF－α及fgl2凝血酶原酶mRNA表達收集培養(yǎng)24 h、48 h后經處理的細胞，用Trizol一步法抽取細胞總RNA。采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，按照試劑說明書步驟進行RT－PCR檢測，以GAPDH引物為內參。擴增條件：預變性：95℃10 min；PCR反應：95℃15 s，60℃45 s，40個循環(huán)。數據采用儀器自帶軟件分析TNF－α、fgl2凝血酶原酶基因在細胞中的相對表達量。引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計學分析應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以平均值±標準差（±s）表示。數據符合正態(tài)分布且方差齊時，多組間比較采用單因素方差分析；若數據服從雙變量正態(tài)分布，采用Pearson相關分析；若數據不服從雙變量正態(tài)分布，采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 益腎泄?jié)岱胶幯鍖Ω咛黔h(huán)境下人腎小球內皮細胞增殖的影響與同期空白組比較，模型組細胞增殖率明顯降低（P＜0.05），說明高糖環(huán)境能減弱HRGECs的增殖活性。與同期模型組比較，空白血清對照組細胞增殖無明顯變化（P＞0.05）；益腎泄?jié)岱胶幯宓汀⒏邉┝拷M細胞增殖活性明顯提高（P＜0.05）。說明益腎泄?jié)岱侥苊黠@提高高糖環(huán)境下HRGECs的增殖活性。見表2。

表2 不同時間各組細胞增殖變化 （±s，n＝9，%）

表2 不同時間各組細胞增殖變化 （±s，n＝9，%）

注：與同期空白組比較，*P＜0.05；與同期模型組比較，△P＜0.05；與同期空白血清對照組比較，＃P＜0.05

組別24 h 48 h空白組48.10±0.90 82.00±1.00模型組 39.30±0.70*50.20±1.00*空白血清對照組 39.80±1.10 50.70±1.50益腎泄?jié)岱胶幯宓蛣┝拷M43.40±1.50△＃68.40±0.70△＃益腎泄?jié)岱胶幯甯邉┝拷M46.30±0.90△＃68.80±0.90△＃

3.2 益腎泄?jié)岱胶幯鍖Ω咛黔h(huán)境下人腎小球內皮細胞上清中TNF－α、fgl2凝血酶原酶的影響

與同期空白組比較，模型組HRGECs上清中TNF－α、fgl2凝血酶原酶的水平顯著升高（P＜0.05）。與同期模型組比較，空白血清對照組細胞上清中TNF－α、fgl2凝血酶原酶的水平無明顯變化（P＞0.05）；益腎泄?jié)岱胶幯宓?、高劑量組細胞上清中TNF－α和fgl2凝血酶原酶的水平顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 不同時間各組細胞上清中TNF－α、fgl2凝血酶原酶的變化 （±s，n＝9，ng·L－1）

表3 不同時間各組細胞上清中TNF－α、fgl2凝血酶原酶的變化 （±s，n＝9，ng·L－1）

注：與同期空白組比較，*P＜0.05；與同期模型組比較，△P＜0.05；與同期空白血清對照組比較，＃P＜0.05

組別 TNF－α fgl2凝血酶原酶24 h 48 h空白組 225.94±11.21 213.86±9.44 1 965.98±164.71 2 1 24 h 48 h 01.39±98.43模型組 549.71±30.99* 653.22±51.00* 5 099.66±177.86* 6 055.65±240.59*空白血清對照組 547.79±28.89 635.85±18.91 4 930.91±169.07 5 946.70±380.47益腎泄?jié)岱胶幯宓蛣┝?418.61±17.08△＃ 350.48±14.60△＃ 4 248.38±157.30△＃ 3 611.08±165.65△＃益腎泄?jié)岱胶幯甯邉┝?356.44±23.07△＃ 298.04±15.31△＃ 3 675.25±156.75△＃ 2 980.63±91.67△＃

3.3 益腎泄?jié)岱胶幯鍖Ω咛黔h(huán)境下人腎小球內皮細胞TNF－αmRNA、fgl2凝血酶原酶mRNA表達的影響與同期空白組比較，模型組HRGECs中TNF－αmRNA及fgl2凝血酶原酶mRNA的表達明顯升高（P＜0.05）。與同期模型組比較，空白血清對照組HRGECs中TNF－αmRNA及fgl2凝血酶原酶mRNA的表達無明顯變化；益腎泄?jié)岱胶幯宓?、高劑量組HRGECs中TNF－αmRNA及fgl2凝血酶原酶mRNA的表達明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組不同時間點TNF－αmRNA、fgl2凝血酶原酶mRNA含量變化 （±s，n＝9，%）

表4 各組不同時間點TNF－αmRNA、fgl2凝血酶原酶mRNA含量變化 （±s，n＝9，%）

注：與同期空白組比較，*P＜0.05；與同期模型組比較，△P＜0.05；與同期空白血清對照組比較，＃P＜0.05

組別 TNF－αmRNA fgl2凝血酶原酶mRNA 24 h 48 h空白對照組24 h 48 h 1.10±0.30 1.00±0.20 1.00±0.30 1.00±0.20模型組 4.8±0.90* 5.60±0.70* 4.90±0.40* 5.70±0.50*空白血清對照組 4.70±0.80 5.50±0.70 4.80±0.40 5.60±0.60益腎泄?jié)岱胶幯宓蛣┝?3.50±0.60△＃ 3.10±0.60△＃ 3.40±0.20△＃ 3.30±0.30△＃益腎泄?jié)岱胶幯甯邉┝?1.80±0.20△＃ 1.40±0.20△＃ 1.90±0.20△＃ 1.40±0.10△＃

3.4 人腎小球內皮細胞TNF－α與fgl2凝血酶原酶的相關性分析采用Pearson相關分析對腎小球內皮細胞上清中TNF－α與fgl2凝血酶原酶的水平進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)腎小球內皮細胞上清中TNF－α與fgl2凝血酶原酶的表達呈正相關性；采用Pearson相關分析對腎小球內皮細胞中TNF－α mRNA與fgl2凝血酶原酶mRNA的表達進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)腎小球內皮細胞TNF－αmRNA與fgl2凝血酶原酶mRNA的表達呈正相關關系。表明腎小球內皮細胞的免疫凝血可能由TNF－α介導。見表5。

表5 人腎小球內皮細胞TNF－α與fgl2凝血酶原酶的相關性分析 （xˉ±s）

4 討論

中醫(yī)認為，DN的病機為本虛標實，在臨床辨證中，又分為氣陰兩虛、脾腎虧虛、瘀濁阻絡等，其中，“瘀阻腎絡”是DN發(fā)病的關鍵因素?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，DN的發(fā)病過程中，腎小球內皮細胞損傷導致微循環(huán)障礙，從而引起腎小球硬化是其主要發(fā)病原因［4］，這與中醫(yī)理論中的“瘀阻腎絡”理論相似。

目前，臨床上治療DN多以益氣養(yǎng)陰、健脾補腎、化瘀泄?jié)釣橹?，在防治患者腎功能惡化、改善患者臨床癥狀等方面取得了一定的療效。益腎泄?jié)岱绞俏铱浦委烡N的常用經驗方，主要由黃芪、太子參、淫羊藿、酒黃精、生地黃、紅花、炙水蛭、熟大黃等組成。此方權衡氣血陰陽，補瀉兼施，滋溫并用，其中黃芪、太子參大補元氣、益氣生血，淫羊藿溫補元陽，黃精滋養(yǎng)腎陰，生地黃養(yǎng)陰生津，紅花、水蛭祛瘀通絡，大黃蕩滌積滯血中穢濁之邪，各藥并用，共奏益氣補腎、化瘀泄?jié)嶂?，在改善腎臟微循環(huán)及DN的早期治療中收獲良效。

現(xiàn)代藥理學研究表明，黃芪能通過降低甘油三酯（triglyceride，TG）、膽固醇（cholesterol，TC）、內皮素－1（endothelin－1，ET－1），提高一氧化氮（nitric oxide，NO）、降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP），降低早期DN患者的尿白蛋白排泄率來保護腎臟功能，其作用獨立于降血壓及降血糖之外［5－8］。研究發(fā)現(xiàn)，太子參多糖能升高DN大鼠血清消脂素水平，降低TNF－α水平及DN大鼠的血脂及腎臟指數，通過多途徑發(fā)揮治療作用，從而起到腎臟保護的作用［9－10］。牛效清等［11－13］發(fā)現(xiàn)，淫羊藿水煎劑可以降低血透患者血清TNF－α水平，保護DN大鼠內皮細胞，改善其腎動脈舒縮功能，發(fā)揮腎功能保護作用。黃精具有降血糖、降血脂、調節(jié)免疫、抗炎等作用，可有效控制血糖及保護腎臟的作用［14］?！渡褶r本草經》中記載生地黃能“逐血痹”?，F(xiàn)代藥理研究表明，生地黃具有抗炎及調節(jié)免疫的功能。呂高紅等［15］研究發(fā)現(xiàn)，生地黃具有促進血管內皮細胞增殖的作用，阻止DN的發(fā)生發(fā)展?！侗静菥V目》記載紅花有“活血、潤燥、止痛、散腫、通經”的作用。而現(xiàn)代藥理研究表明，紅花可以明顯降低血液流變學異?；颊叩难ざ?，進而改善其血液流動性，還可以通過抑制DN大鼠腎臟的氧化應激反應，下調細胞外基質蛋白的表達，起到腎臟保護的作用，進而延緩DN的發(fā)生與發(fā)展。除此之外，紅花能通過抗纖維化、降血脂、降尿蛋白、抑制細胞凋亡、抗炎等途徑來保護腎臟［16－19］。水蛭具有拮抗類炎性介質的作用［20－21］，能高效清除體內循環(huán)免疫復合物，從而有效調節(jié)機體的免疫功能；同時能明顯減少纖維蛋白相關抗原沉積于腎小球內，改善腎小球內皮細胞增殖，延緩腎小球硬化，從而減少蛋白尿、糾正低蛋白血癥，保護腎功能。熟大黃主要通過抗炎、抗氧化、改善血液高凝狀態(tài)、改善微循環(huán)、抗纖維化等方面來保護糖尿病引起的腎臟損傷［22－25］。

我科前期動物實驗證實，益腎泄?jié)岱娇赏ㄟ^調控血脂、血纖維蛋白原，減少DN大鼠腎臟局部fgl2凝血酶原酶、轉化生長因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）的合成和釋放，增加DN大鼠體質量，有效控制血糖、血肌酐水平，改善腎功能。

腎小球內皮細胞損傷在DN的發(fā)生發(fā)展過程中起到相當關鍵的作用，其位于血管和淋巴管內表面上，是一層連續(xù)排列的扁平內皮細胞［26］，并布滿窗孔，存有基底膜和糖萼［27－28］，是腎小球濾過屏障的重要部分，在腎小球凝血、免疫和炎癥反應中均起到重要的調控作用。研究表明，高糖環(huán)境下HRGECs發(fā)生病變可能的機制是損傷的腎小球內皮細胞通過激活凝血系統(tǒng)，導致微血栓形成，同時釋放出大量生物活性物質，改變腎臟局部的血流動力學，提高腎臟血管內皮通透性，從而出現(xiàn)一系列相關的病理變化［29］。SU等［30］發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠腎小球內皮細胞中fgl2凝血酶原酶的陽性表達，可導致腎臟微血栓的形成，且與TNF－α密切相關。

TNF－α是分子量為34 kDa的跨膜同源三聚體蛋白，其主要通過浸潤T細胞和單核細胞／巨噬細胞合成，但幾乎所有的腎臟細胞，包括腎小球系膜細胞、足細胞、腎小球內皮細胞和腎小管細胞都能夠產生TNF－α［31］。在腎臟固有細胞中，高血糖和糖基化終產物可以誘導TNF－α的產生，導致TNF－α在DN患者的血清、尿液中均有升高，且其濃度的變化可以在DN病程中體現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，益腎泄?jié)岱胶幯迥芙档图毎锨逯蠺NF－α的水平，減少細胞TNF－αmRNA的表達。

fgl2凝血酶原酶是一種分子量近70000 kDa的Ⅱ型膜蛋白，屬于纖維蛋白原家族，是新近發(fā)現(xiàn)的一種促凝因子，參與微血栓的形成。fgl2凝血酶原酶是一種直接激活凝血酶原的凝血因子，可以直接催化凝血酶原轉化為凝血酶而啟動凝血過程，是一條獨立的凝血途徑，同時，它可能還具有黏附相關的細胞活性因子樣作用并參與腸黏膜固有層免疫細胞的更新等作用［32］。fgl2凝血酶原酶主要表達于巨噬細胞、血管內皮細胞、胎兒滋養(yǎng)層細胞和蛻膜基質細胞等，但在人體各臟器中的表達強弱不同。fgl2凝血酶原酶的表達只在病理情況下增強，即只有在巨噬細胞和血管內皮細胞等免疫活性細胞被活化時才出現(xiàn)高表達，從而啟動特異性凝血過程。因此，LEVY等［33］將fgl2凝血酶原酶的促凝途徑稱為“免疫凝血”。汪艷等［3］發(fā)現(xiàn)，DN大鼠腎小球毛細血管內皮細胞中可見fgl2凝血酶原酶陽性表達，提示fgl2凝血酶原酶介導的凝血途徑在促進糖尿病腎臟微血栓形成和腎病微血管病變的發(fā)展中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，益腎泄?jié)岱胶幯迥芙档图毎锨錰gl2凝血酶原酶的水平，減少細胞fgl2凝血酶原酶mRNA表達。

已有研究表明，TNF－α可介導fgl2凝血酶原酶在內皮細胞中轉錄［34］，同時在2型糖尿病大鼠腎臟中也發(fā)現(xiàn)TNF－α與fgl2凝血酶原酶的表達呈正相關關系。在本研究中，無論是細胞上清中的TNF－α和fgl2凝血酶原酶的水平還是細胞中TNF－αmRNA和fgl2凝血酶原酶mRNA的表達，兩者都呈正相關關系，與既往研究結果一致。推測，在高糖環(huán)境下，HRGECs功能受損后可引起TNF－α等炎癥介質釋放，使fgl2凝血酶原酶mRNA特異性表達，從而導致腎臟局部凝血功能障礙，產生高凝狀態(tài)，形成微血栓，影響細胞屏障功能、增加細胞通透性并破壞膜的穩(wěn)定性，加速腎臟纖維化過程。

綜上所述，益腎泄?jié)岱胶幯蹇商岣吒咛黔h(huán)境下人腎小球內皮細胞的增殖能力，降低細胞上清中TNF－α及fgl2凝血酶原酶的水平，下調TNF－α mRNA及fgl2凝血酶原酶mRNA的特異性表達，保護內皮細胞，且TNF－α及fgl2凝血酶原酶的水平及mRNA的表達均成正相關關系，表明腎小球內皮細胞的免疫凝血可能由TNF－α介導。