湯 慶,李 松,鐘元鋒,李 晨,劉 沛,田學(xué)文,劉為勇,孫自鏞,李輝軍

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430030

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳播迅速，當(dāng)前國內(nèi)外防治形勢異常嚴(yán)峻[1-3]。機(jī)體感染SARS-CoV-2后可引起適應(yīng)性體液免疫應(yīng)答，約7 d會(huì)產(chǎn)生針對性IgM抗體，約14 d產(chǎn)生IgG抗體[1]。然而，有報(bào)道稱2.0%～8.5%患者在感染SARS-CoV-2后沒有出現(xiàn)SARS-CoV-2抗體[4]。目前國內(nèi)關(guān)于新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者不產(chǎn)生抗體的報(bào)道較少，本研究對SARS-CoV-2抗體陰性及抗體陽性患者的炎癥因子表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，旨在為COVID-19的臨床治療及疫苗研發(fā)提供一些參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1—2月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院中法新城院區(qū)定點(diǎn)收治住院確診的COVID-19患者212例為研究對象，按照患者自檢出核酸陽性起2周后是否產(chǎn)生SARS-CoV-2抗體將其分為抗體陰性組44例，其中男性22例、女性22例，平均年齡(52.8±17.9)歲；以及抗體陽性組168例，其中男性80例、女性88例，平均年齡(59.4±13.8)歲；抗體陽性組中含SARS-CoV-2 IgM抗體陽性137例，SARS-CoV-2 IgG抗體陽性168例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有流行病學(xué)接觸史；(2)有發(fā)熱、咳嗽等癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞水平降低，胸部CT檢查顯示病毒性肺炎改變，且按國家衛(wèi)生健康委員會(huì)新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)[5]臨床診斷為COVID-19。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18歲，急診入院診斷不明確或資料缺失。收集患者的年齡、性別、住院天數(shù)、臨床分型、臨床結(jié)局、基礎(chǔ)性疾病及呼吸輔助情況等一般臨床資料進(jìn)行研究分析。本研究通過華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。本文屬于回顧性研究免除患者知情同意書。

1.2儀器與試劑 SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體采用深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司iFlash3000 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測，試劑及定標(biāo)品為原裝配套；全血細(xì)胞計(jì)數(shù)采用日本SYSMEX XN3000全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測，試劑為其配套試劑。超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)采用德國羅氏COMBAS 8000全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測，試劑及定標(biāo)品購自日本生研，乳酸脫氫酶(LDH)采用德國羅氏COMBAS 8000全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測，試劑及定標(biāo)品為原裝配套。白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-2R、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)采用SIEMENSIMMULITE 1000免疫分析儀進(jìn)行檢測，試劑及定標(biāo)品為原裝配套。IL-6采用Roche e602電化學(xué)發(fā)光法檢測儀進(jìn)行檢測，試劑及定標(biāo)品為原裝配套。檢測標(biāo)本均按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，保證所有檢測系統(tǒng)平穩(wěn)無故障且待測項(xiàng)目室內(nèi)質(zhì)控均為在控狀態(tài)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及處理 所有患者均于入院24 h內(nèi)完成靜脈血標(biāo)本采集，全血細(xì)胞計(jì)數(shù)采用乙二胺四乙酸抗凝劑、hs-CRP采用肝素鋰抗凝劑、D-二聚體及纖維蛋白原(FIB)采用枸櫞酸鈉抗凝劑、細(xì)胞因子及SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體采用二氧化硅/分離膠的采血管采集。需離心標(biāo)本采用3 500 r/m離心10 min，不能立即檢測的標(biāo)本暫存于4 ℃冰箱中，需長期保存的血清/血漿標(biāo)本放置于-70 ℃保存。

1.3.2SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測 患者于入院當(dāng)日及擇期進(jìn)行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測，保證所有患者在10～<20 d及20～<30 d均能獲得抗體數(shù)據(jù)。IgM 和 IgG 濃度<10.0 AU/mL時(shí)，為無反應(yīng)性(陰性)；標(biāo)本IgM和IgG濃度≥10.0 AU/mL時(shí)認(rèn)為有反應(yīng)性(陽性)。

1.3.3細(xì)胞因子檢測 收到標(biāo)本時(shí)立即對細(xì)胞因子進(jìn)行離心上機(jī)檢測，避免放置較長時(shí)間。IL-1β、IL-2R、IL-8、IL-10、IL-6、TNF-α參考范圍分別為<5.0 pg/mL、223.0～710.0 U/mL、<62.0 pg/mL、<9.1 pg/mL、<8.1 pg/mL、<7.0 pg/mL。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床資料比較 抗體陰性組年齡、住院天數(shù)小于抗體陽性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 COVID-19住院患者一般臨床資料

2.2兩組SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體滴度變化 抗體陰性組自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d及20～<30 d血清中均未檢測出SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體?？贵w陽性組自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d及20～<30 d血清中檢出SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體?？贵w陽性組自檢出COVID-19核酸陽性后20～<30 d SARS-CoV-2 IgG抗體滴度較自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d升高，而抗體陽性組自檢出COVID-19核酸陽性后20～<30 d SARS-CoV-2 IgM抗體滴度較自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d降低。見表2。

表2 兩組SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體滴度變化[S/CO，M(P25,P75)]

續(xù)表2 兩組SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體滴度變化[S/CO，M(P25,P75)]

2.3抗體陽性組與抗體陰性組患者入院時(shí)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的差異分析 抗體陽性組WBC、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(MONO)、RBC、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、IL-2R、IL-10、TNF-α與抗體陰性組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而抗體陽性組hs-CRP、LDH、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、D-二聚體及FIB高于抗體陰性組，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYMPH)、血紅蛋白濃度(HGB)及血細(xì)胞比容(Hct)低于抗體陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 SARS-CoV-2 IgM、IgG抗體陽性組與抗體陰性組患者入院時(shí)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)分析

3 討 論

目前由于缺乏COVID-19有效的治療藥物，該病給全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了巨大挑戰(zhàn)[6]。機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫在抗病毒感染中起著至關(guān)重要的作用[7]。有研究報(bào)道，機(jī)體在感染SARS-CoV-2 1周后血清中可檢測到SARS-CoV-2 IgM抗體，發(fā)病2周后上升到峰值，3～4周后開始下降，SARS-CoV-2 IgG抗體轉(zhuǎn)陽的中位數(shù)時(shí)間為12～14 d[8]。本研究發(fā)現(xiàn)抗體陰性組血清中未檢測到SARS-CoV-2 IgG抗體、SARS-CoV-2 IgM抗體，與抗體陽性組相比，抗體陰性組年齡較小，且住院天數(shù)較短?？贵w陰性組患者年齡較小、恢復(fù)較快，可能體內(nèi)存在其他方式的免疫反應(yīng)，比如細(xì)胞免疫，特異性IgA抗體、細(xì)胞因子等促進(jìn)患者恢復(fù)[9]。兩組臨床分型、臨床結(jié)局、呼吸機(jī)輔助通氣治療方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能是由于收治患者病情偏重，同時(shí)患者合并基礎(chǔ)疾病較重，如急性腦梗死、急性冠心病、惡性腫瘤等。然而，具體原因還需要后續(xù)繼續(xù)進(jìn)行更大樣本及更深入的研究。

SARS-CoV-2感染后，引起機(jī)體免疫應(yīng)答的同時(shí)，也活化了各種細(xì)胞信號(hào)，導(dǎo)致炎癥因子大量釋放，引起細(xì)胞因子風(fēng)暴。炎癥因子的釋放是一種應(yīng)激反應(yīng)，一方面有利于病毒清除，然而失控的炎性反應(yīng)和免疫紊亂會(huì)引起多器官免疫病理損傷[10]，有研究表明，COVID-19患者可出現(xiàn)細(xì)胞因子水平升高，并與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11-12]，可能與患者存在免疫失衡及其導(dǎo)致的細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)有關(guān)[13]。IL-6 是誘發(fā)CRS 的重要因子，可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)來破壞血管屏障穩(wěn)定性，從而刺激單核細(xì)胞表達(dá)更多的組織因子，加劇外源性凝血系統(tǒng)活化，生成的凝血酶反過來又可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮產(chǎn)生更多的IL-6 及其他細(xì)胞因子，這樣“細(xì)胞因子風(fēng)暴”與凝血系統(tǒng)紊亂形成了惡性循環(huán)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)抗體陽性組體內(nèi)血清hs-CRP、LDH、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、D-二聚體及FIB水平高于抗體陰性組，表明未檢測到SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體的COVID-19患者體內(nèi)的炎性反應(yīng)水平較輕。這類患者感染可能局限于呼吸道黏膜細(xì)胞，或者感染的病毒載量較小，抗體反應(yīng)主要由分泌性免疫系統(tǒng)控制，故引起全身性的炎性反應(yīng)較小。由于抗體陰性組樣本量較少，故本研究中無法在年齡與住院天數(shù)進(jìn)行匹配，關(guān)于年齡及住院天數(shù)對細(xì)胞因子水平是否有影響還需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，未檢測到SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體的COVID-19患者相對于抗體陽性患者其體內(nèi)炎性反應(yīng)較輕，病程較短，其為臨床治療及疫苗的研發(fā)提供一些參考依據(jù)。