電針調(diào)節(jié)肝臟PPARα、GLUT4表達(dá)改善ZDF大鼠糖脂代謝的機(jī)制研究*

段浩茹，李 瑞，李秋艷，莊舒婷，宋姍姍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)是一種以胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)合并胰島素相對(duì)分泌不足為特點(diǎn)的代謝紊亂性疾病，常伴有脂代謝異常。越來越多的文獻(xiàn)證明，脂代謝紊亂不是以往認(rèn)為的繼發(fā)于T2DM之后，而是引起IR的重要原因。單純降糖已不再是治療T2DM的終極目標(biāo)，應(yīng)聯(lián)合治療血糖、血脂紊亂[1]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞因子可參與T2DM發(fā)生發(fā)展[2]，而肝臟作為能量代謝的重要器官能夠通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(Glucose transporter-4,GLUT4)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(Proliferator-activated receptorα,PPARα)發(fā)揮調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[3-4]。針刺調(diào)節(jié)T2DM血糖、血脂水平療效肯定，已被WHO列為可行的治療方式之一[5]，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍未完全闡明，故本研究以IR伴肥胖的自發(fā)型糖尿病動(dòng)物模型Zucker糖尿病肥胖(Zucker Diabetic Fatty,ZDF)大鼠為研究對(duì)象，以低頻電針為干預(yù)手段，探索電針調(diào)節(jié)糖脂代謝的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)與指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性ZDF(fa/fa)大鼠14只，體質(zhì)量175～225 g，同期出生8周齡雄性Zucker瘦型(Zucker Lean, ZL)(fa/+)大鼠7只，體質(zhì)量140～180 g。動(dòng)物購買自北京維通利華生物科技有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度23 ℃，相對(duì)濕度60%，空氣流通，12 h晝夜循環(huán)光照。所有動(dòng)物普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后改用purina#5008飼料誘導(dǎo)成模。實(shí)驗(yàn)過程遵循2006年國家科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

Purina#5008飼料(美國PMI營養(yǎng)國際有限公司，成分：粗脂肪7.1%，粗蛋白24.0%);羅氏ACCU-CHEK performa血糖儀(羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司);羅氏血糖試紙(羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司);華佗牌電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);無菌針灸針(0.22 mm×13 mm，北京中研太和醫(yī)藥有限公司)；PPARα兔多克隆抗體(貨號(hào)：15540)，GLUT4鼠單克隆抗體(貨號(hào)：66846)，GAPDH兔多克隆抗體(貨號(hào)：10494)，均購自美國Abcam公司。

1.3 模型制備與動(dòng)物分組

所有動(dòng)物均以purina#5008飼料誘導(dǎo)飼喂4周并以空腹血糖及餐后2 h血糖均>11.1 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)。成模后的ZDF大鼠按空腹血糖高低隨機(jī)區(qū)分為模型組和電針組，7只ZL大鼠為空白組。造模及電針干預(yù)期間均以purina#5008飼料喂養(yǎng)。

1.4 干預(yù)方法

電針組：將大鼠以自制鼠套固定并暴露下肢及背部，靜置5 min待大鼠適應(yīng)及情緒穩(wěn)定后，針刺大鼠雙側(cè)脾俞、胰俞、后三里和三陰交穴，取穴及針刺方法按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]進(jìn)行。捻轉(zhuǎn)針身使針下有緊實(shí)感后連接電針儀，接入低頻15 Hz連續(xù)波，電流輸出強(qiáng)度以引起大鼠肌肉輕微抖動(dòng)且無劇烈掙扎為度。電針接入穴位為同側(cè)胰俞、后三里，隔日換對(duì)側(cè)。留針20 min，1次/d，1周6次，連續(xù)干預(yù)4周。模型組、空白組則進(jìn)行與電針組同樣的抓取與固定4周。

1.5 樣本采集及指標(biāo)檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h后，以2%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉。腹主動(dòng)脈取血后室溫靜置2 h，4 ℃，3 000 r/min，離心15 min后取上清液，以放射免疫法檢測(cè)血清相關(guān)指標(biāo)。大鼠處死后，取大鼠肝臟組織，凍存于-80 ℃冰箱，以Western Blot法檢測(cè)PPARα、GLUT4蛋白表達(dá)。

1.5.1 空腹血糖及OGTT試驗(yàn)曲線下面積 自造模起至電針干預(yù)結(jié)束后每周末采用尾尖取血法檢測(cè)并記錄各組大鼠空腹血糖(FBG)。電針干預(yù)前后對(duì)所有大鼠以50%的葡萄糖溶液按2 g/kg灌胃，檢測(cè)灌胃前空腹血糖及灌胃15 min、30 min、1 h和2 h時(shí)間點(diǎn)的血糖，并繪制曲線圖，計(jì)算曲線下面積(OGTT-AUC)。

1.5.2 空腹血脂、血清胰島素以及血清脂肪細(xì)胞因子水平 以放射免疫法檢測(cè)血清胰島素(INS)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(vLDL)、游離脂肪酸(FFA)、脂聯(lián)素(ADP)、抵抗素(Resistin)、瘦素(LEP)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)，計(jì)算公式為：胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(空腹血清胰島素含量×空腹血糖含量)/22.5。

1.5.3 Western Blot法檢測(cè)PPARα、GLUT4蛋白表達(dá)水平 肝臟組織于研缽中加入液氮后快速研磨成粉末，每100 mg粉末組織中加入1 mL裂解液(含10 μL蛋白酶抑制劑)混勻，冰上靜置30 min，4 ℃，10 000 rpm離心15 min后取上清液。BCA蛋白定量后加入5×loding buffer蛋白變性，確保每個(gè)樣品蛋白上樣量一致。制膠(10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠)，上樣(20 μg)，電泳(濃縮膠，60 V，20 min；分離膠，80 V，60 min)，電轉(zhuǎn)(80 V，75 min)。于5%脫脂奶粉(TBST配置)中室溫封閉1.5 h，加入一抗4 ℃孵育過夜(通用型抗體稀釋液配置。PPARα, 1∶1 000; GLUT4,1∶5 000;GAPDH,1∶50 000)，二抗室溫孵育1.5 h(5%脫脂奶粉配置，1∶10 000)，后采用ChemiDoc MP全能型成像系統(tǒng)曝光。采用Image J軟件計(jì)算條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較

造模前，3組大鼠體型相似，均為瘦長(zhǎng)型，精神狀態(tài)良好且活動(dòng)靈活，毛發(fā)有光澤，飲食及大小便均正常；成模后，空白組一般狀態(tài)變化不明顯，模型組與電針組大鼠體型明顯肥胖，精神較萎靡，水平爬行及爬高次數(shù)均減少，毛發(fā)光澤度降低且有斷毛現(xiàn)象，飲食飲水增加，排便排尿量明顯增多，并具有明顯異味；電針干預(yù)后大鼠較模型組體型變化不明顯，活動(dòng)狀態(tài)、精神狀態(tài)、皮毛色澤及斷毛現(xiàn)象改善，飲食飲水變化不明顯，排便情況有所改善。

2.2 各組大鼠FBG及OGTT試驗(yàn)曲線下面積變化情況

電針干預(yù)前，模型組大鼠FBG、OGTT-AUC明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與電針組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后模型組FBG、OGTT-AUC與空白組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；電針組FBG、OGTT-AUC與模型組比較明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示電針具有一定降糖效應(yīng)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后FBG、OGTT-AUC變化情況

圖1 各組大鼠干預(yù)前后OGTT試驗(yàn)曲線圖

2.3 各組大鼠血清INS含量及HOMA-IR比較

干預(yù)結(jié)束后與空白組比較，模型組血清INS含量及HOMA-IR升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組血清INS含量及HOMA-IR降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠空腹血清INS、HOMA-IR比較

2.4 各組大鼠血清TC、TG、HDL、LDL、vLDL及FFA含量比較

干預(yù)結(jié)束后與空白組比較，模型組血清TC、TG、HDL、vLDL及FFA含量升高(P<0.01)，LDL含量升高(P<0.05)；與模型組比較，電針組血清TC、HDL、LDL、vLDL及FFA含量降低(P<0.01)，血清TG含量雖有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清TC、TG、HDL、LDL、vLDL及FFA水平比較

2.5 各組大鼠血清脂肪細(xì)胞因子含量比較

干預(yù)結(jié)束后，與空白組相比，模型組血清ADP含量降低，血清LEP、Resistin及TNF-α含量升高(P<0.01)；與模型組相比，電針組血清ADP含量上升，血清LEP、Resistin及TNF-α含量下降(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠血清脂肪細(xì)胞因子水平比較

2.6 各組大鼠肝臟PPARα、GLUT4蛋白表達(dá)情況比較

與空白組比較，模型組大鼠肝臟PPARα、GLUT4蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組大鼠肝臟PPARα、GLUT4蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表5、圖2。

表5 各組大鼠肝臟PPARα、GLUT4蛋白表達(dá)情況比較

圖2 各組大鼠肝臟PPARα、GLUT4蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

2型糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病率逐年上升，對(duì)人類健康及國家醫(yī)療支出形成了極大的威脅，因此T2DM動(dòng)物模型的選擇及安全的治療方式成為迫切需要解決的全球性難題。ZDF大鼠是高血糖Zucker(Zuker fatty rat)大鼠的1個(gè)亞系，與之相比肥胖程度有所減輕而IR更加明顯，雄性ZDF大鼠在5%脂肪含量飲食的飼喂條件下，幾乎100%會(huì)發(fā)生糖尿病，飲食脂肪含量的增加可加速這一進(jìn)程，是理想的糖尿病胰島素抵抗動(dòng)物模型之一，而雌性大鼠只有經(jīng)專門的高脂飲食誘導(dǎo)才能發(fā)展為糖尿??；ZL大鼠是瘦型非糖尿病的動(dòng)物模型，外表與ZDF大鼠無明顯差別，常用于ZDF大鼠的空白對(duì)照[7-8]。

研究已證明[9-11]，電針能夠調(diào)節(jié)糖脂水平，有效治療T2DM及胰島素抵抗，不僅無毒副作用，還能大大降低患者醫(yī)療開銷，緩解社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是中醫(yī)學(xué)在現(xiàn)代的繼承與發(fā)揚(yáng)。本研究基于導(dǎo)師李瑞教授多年豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)及以往科研成果提出滋陰清熱穴組治療T2DM。針對(duì)消渴病陰虛燥熱之病機(jī)，選擇“養(yǎng)陰要穴”三陰交以滋陰補(bǔ)腎，足三里以清陽明燥熱，脾俞以運(yùn)化津液，胰俞為治療消渴病的經(jīng)驗(yàn)要穴且位于胰腺的同神經(jīng)節(jié)段支配區(qū)域，其降糖效果十分明顯，優(yōu)于其他背俞穴[12]。以上四穴清滋并舉、扶正祛邪，共奏調(diào)理臟腑氣血津液失衡之功。本研究經(jīng)4周干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，電針可控制持續(xù)purina#5008飼喂條件下ZDF大鼠血糖的上升趨勢(shì)，緩解脂代謝紊亂，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。但值得注意的是，在人體內(nèi)作為保護(hù)性因子存在的HDL，在空白組ZL大鼠血清內(nèi)含量較低，ZDF糖尿病大鼠體內(nèi)反而是升高的，電針干預(yù)可降低其水平，這與Zhou Y、宋姍姍等[13-14]的研究結(jié)果一致，其發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

肝臟是重要的能量代謝場(chǎng)所，也是胰島素作用的主要靶器官之一，在糖脂代謝中發(fā)揮重要功能。從肝臟調(diào)節(jié)糖脂代謝入手，對(duì)探索2型糖尿病的發(fā)病及治療機(jī)制具有重要作用。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(Glucose transporter-4, GLUT4)是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體蛋白，是胰島素信號(hào)通路下游的重要分子，通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以促進(jìn)葡萄糖的攝取，在肝臟組織葡萄糖利用中發(fā)揮限速作用[15]。T2DM小鼠肝臟中GLUT4表達(dá)降低，是肝臟胰島素抵抗的重要原因之一[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，ZDF大鼠肝臟GLUT4蛋白表達(dá)下降，而電針可提高其表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮降糖作用，緩解ZDF大鼠的IR狀態(tài)。過氧化物酶體增殖物激活受體α(Proliferator-activated receptorα,PPARα)屬于核受體超家族成員，與IR的發(fā)生發(fā)展亦密切相關(guān)[17]。其作為脂質(zhì)供給的總感受器，在組織中廣泛表達(dá)，參與調(diào)節(jié)脂肪酸的跨膜運(yùn)輸與氧化分解，進(jìn)而降低游離脂肪酸的堆積以及血脂濃度。PPARα還可調(diào)節(jié)胰島素敏感性，研究發(fā)現(xiàn)PPARα敲除的小鼠更容易出現(xiàn)IR[18-19]。本研究結(jié)果顯示，電針可上調(diào)ZDF糖尿病大鼠肝臟中PPARα蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)各項(xiàng)血脂水平，從而改善脂代謝、減輕IR。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞因子包括脂聯(lián)素(ADP)、瘦素(LEP)、抵抗素(Resistin)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等在內(nèi)，能夠調(diào)節(jié)血糖血脂水平，調(diào)控胰島素信號(hào)通路，介導(dǎo)多種代謝性疾病的進(jìn)程[2]。其中ADP屬于保護(hù)性細(xì)胞因子，具有胰島素增敏性，可通過增強(qiáng)胰島素活性、抑制糖異生關(guān)鍵酶來降低血糖；還可促進(jìn)脂質(zhì)分解進(jìn)而改善脂代謝紊亂[20]。研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可促進(jìn)胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)，與胰島素及血糖的下降關(guān)系密切[21]。LEP可增加能量消耗，抑制脂質(zhì)合成。IR時(shí)常伴L(zhǎng)EP抵抗，其無法發(fā)揮正常功能，對(duì)胰島素的反饋?zhàn)饔脺p弱，進(jìn)而加重高胰島素血癥及T2DM的病情[22]。Resistin因升高血糖、拮抗胰島素作用而命名，不僅能改變胰島素信號(hào)通路受體及其底物的結(jié)構(gòu)而介導(dǎo)IR，還能降低外周組織對(duì)胰島素的敏感性，抑制血糖的攝取利用。此外，抵抗素促進(jìn)脂肪分解、減弱胰島素抑制脂解的功能可導(dǎo)致游離脂肪酸增加，進(jìn)一步促進(jìn)IR[23]。據(jù)研究報(bào)道，TNF-α參與促炎、免疫反應(yīng)外，也可促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂解，進(jìn)而加速肥胖和IR的進(jìn)程[24]。本研究結(jié)果可見，與空白組比較，模型組大鼠血清LEP、TNF-α和Resistin水平上升，ADP水平降低，提示脂肪細(xì)胞因子共同參與了ZDF大鼠T2DM糖脂代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展。而電針能夠發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用，上調(diào)ADP的同時(shí)下調(diào)LEP、Resistin及TNF-α的含量，進(jìn)而調(diào)節(jié)糖脂代謝、緩解IR。

綜上所述，電針可提高ZDF大鼠肝臟PPARα、GLUT4蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)血清脂肪細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而發(fā)揮降糖降脂、緩解IR的作用。而電針是否作用于其他組織、細(xì)胞靶點(diǎn)發(fā)揮作用，脂肪細(xì)胞因子是否能夠作用于上下游分子以調(diào)節(jié)PPARα、GLUT4表達(dá)從而改善糖脂代謝，以及不同參數(shù)電針降糖降脂的療效如何，電針預(yù)刺激是否能預(yù)防、延緩T2DM及IR發(fā)生發(fā)展，筆者將會(huì)在接下來的研究中進(jìn)一步闡明。