陸 立，盧仁泉，孫佳俊，陸 凝，郭 林

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

原發(fā)性肺癌是中國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位居各類癌癥首位，其發(fā)病隱匿，約50%的患者確診時為晚期［1-2］。骨骼是肺癌主要的轉移部位之一，首診肺癌晚期患者中骨轉移發(fā)生率為30%～40%，其中80%以上位于軀干骨中，包括脊柱、肋骨和骨盆［3-5］。骨轉移往往預示著患者的生存期縮短，其引起的嚴重骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫綜合征等骨相關事件（skeletal-related events，SRE）及相關治療帶來的痛苦，嚴重影響患者的生活質量［6］。臨床數據表明，肺癌合并骨轉移患者在發(fā)生首次SRE后，中位生存時間僅為4.1個月［7］。因此，如何早期診斷骨轉移，進行療效的監(jiān)測評估，對延長肺癌患者的生存期及改善預后意義重大。目前，骨轉移的診斷主要依賴影像學檢查，如發(fā)射型計算機體層成像（emission computed tomography，ECT）和正電子發(fā)射計算機體層顯像（positron emission tomography and computed tomography，PET/CT）檢查等。這些檢查部分存在特異度較低、易出現假陽性結果、價格相對昂貴、難以反復檢查等缺點［8-9］。而臨床常用的腫瘤標志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）、細胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）等，主要用于肺癌患者的鑒別診斷。有研究［10-11］表明，上述腫瘤標志物也可應用于腫瘤分期、療效判斷和預后評估，但并未證實其與骨轉移相關。

肺癌骨轉移的病理學基礎主要是腫瘤細胞與破骨細胞及成骨細胞間的相互作用，腫瘤細胞釋放的可溶性介質能夠激活破骨細胞和成骨細胞，而破骨細胞釋放的細胞因子又能進一步促進前者釋放介質，從而形成惡性循環(huán)，破壞正常骨組織中骨吸收與骨形成的動態(tài)平衡［12-13］。骨代謝紊亂使得骨代謝指標發(fā)生變化。已有相關研究［14-16］表明，檢測血清中骨代謝指標的表達水平對肺癌骨轉移的診斷和監(jiān)測具有潛在價值。本研究對231例原發(fā)性肺癌患者及69名健康體檢者的N端中分子片段（N-terminal mid-frament，N-MID）表達水平進行測定，探索其在臨床應用中的價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2017年3月—2018年2月復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的原發(fā)性肺癌患者231例，中位年齡61歲（21～82歲），其中97例為肺癌合并骨轉移的患者，134例為未骨轉移的肺癌患者。肺癌的確診以活檢或組織細胞學檢查結果為準，骨轉移的確診以ECT或PET/CT檢查結果為準［17-19］。選取69名同期健康體檢者作為健康對照組，中位年齡60歲（22～87歲），所有健康體檢者均無影響骨代謝的相關疾病。3組人群的基本資料見表1，各組的性別、年齡間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究通過復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查，所有患者均由本人或家屬簽署知情同意書。

表1 研究人群一般資料比較Tab.1 General information of study population(n)

1.2 入組與排除標準

入組標準：所有肺癌患者均為未經治療的初發(fā)患者；Karnofsky評分（Karnofsky performance score，KPS）≥70分［18］。排除標準：患有骨代謝性疾?。挥酗L濕性關節(jié)炎或骨關節(jié)炎病史；患有骨質疏松、甲狀腺功能亢進，或由甲狀旁腺功能亢進和皮質醇增多癥等引起的繼發(fā)性骨質疏松；合并嚴重的基礎疾病。

1.3 標本采集與檢測方法

采集患者及健康體檢者靜脈血3～4 mL，以4000 r/min的速度離心10 min，取上層血清，立即檢測或置于-80 ℃冰箱內凍存，1周內檢測。血清N-MID水平測定采用嘉興行健生物科技有限公司的N-MID測定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）。將校準品、質控品和待測樣品加入鏈霉親和素包被的微孔板中，隨后加入生物素標記的N-MID抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的N-MID抗體混合物，進行溫育形成“雙抗體夾心”結構。洗滌后加入HRP基質溶液，再次溫育。微孔板內壁的免疫復合體的酶活性與血清N-MID的濃度成正比。加入終止液后，使用酶標儀在450 nm處測定吸光度（D）值。血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平測定采用瑞士Roche公司的cobas8000-e801自動化學發(fā)光免疫分析儀。血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、血清鈣（calcium，Ca）水平測定采用瑞士Roche公司的cobas8000-c702全自動生化分析儀。

1.4 隨訪

研究截止時間為2021年1月，隨訪終點為研究截止時間、患者骨轉移病灶發(fā)生進展或患者死亡，所有患者均采用含鉑雙藥聯(lián)合化療，同時聯(lián)合唑來膦酸治療。記錄患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）［19］。另檢測50例肺癌合并骨轉移患者治療3、6個月后的血清N-MID水平。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析進行3組間差異比較，方差分析有意義則采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較。計數資料以率表示，采用χ2檢驗和Fisher精確概率法進行各組間率的比較。采用logistic回歸模型分析肺癌患者發(fā)生骨轉移的危險因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估N-MID對肺癌患者骨轉移的診斷價值。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較采用log-rank檢驗。采用重復資料方差分析比較肺癌合并骨轉移患者治療期間血清N-MID水平的變化差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組研究人群治療前血清N-MID表達水平比較

治療前骨轉移組的肺癌患者血清N-MID水平明顯高于無骨轉移組和健康對照組（P均＜0.001）。而無骨轉移組與健康對照組間N-MID水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 3組研究人群治療前血清N-MID表達水平比較Fig.1 Serum N-MID levels of three groups before treatment

2.2 肺癌患者發(fā)生骨轉移的危險因素分析

采用logistic回歸模型進行分析。首先分別對患者的性別、年齡、Ca、CEA、NSE、CYFRA21-1、ALP和N-MID進行單因素分析，結果顯示，CEA（OR=2.448）、NSE（OR=3.308）、CYFRA21-1（OR=2.125）、ALP（OR=4.247）、N-MID（OR=10.027）是肺癌患者發(fā)生骨轉移的危險因素。綜合上述單因素分析中有意義的因素進行多因素聯(lián)合分析，結果顯示，血清N-MID（OR=9.265）和NSE水平（OR=2.688）是肺癌患者發(fā)生骨轉移的危險因素（表2）。

表2 肺癌患者發(fā)生骨轉移的危險因素分析Tab.2 The risk factors of bone metastasis in patients with lung cancer

2.3 血清N-MID表達水平對肺癌患者骨轉移的診斷價值

依據治療前3組研究人群的血清N-MID檢測結果繪制ROC曲線，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.849（圖2）。選擇約登指數最大的切點為臨界點，確定N-MID的最佳臨界值為14.96 ng/mL，此時血清N-MID對肺癌患者骨轉移診斷的靈敏度為77.32%，特異度為78.33%，陽性預測值為63.0%，陰性預測值為87.8%。

圖2 血清N-MID診斷肺癌患者骨轉移的ROC曲線Fig.2 ROC curve of serum N-MID for the diagnosis of bone metastasis in patients with lung cancer

2.4 肺癌患者骨轉移的PFS分析

依據最佳臨界值，將肺癌患者分為N-MID＞14.96 ng/mL組和N-MID≤14.96 ng/mL組，繪制生存曲線，結果顯示，N-MID＞14.96 ng/mL組患者的PFS明顯低于N-MID≤14.96 ng/mL組患者（HR=2.040，P=0.021，圖3）。

圖3 不同N-MID水平患者的PFSFig.3 PFS of patients with different N-MID levels

2.5 血清N-MID表達水平對肺癌合并骨轉移患者的療效監(jiān)測

對50例肺癌合并骨轉移患者治療3、6個月后的血清N-MID水平進行檢測。根據患者是否發(fā)生SRE、疼痛緩解情況及活動受限改善情況分為疾病緩解組和疾病未見緩解或加重組，其中疾病緩解組有33例患者，疾病未見緩解或加重組有17例。治療后疾病緩解患者在治療3、6個月后的血清N-MID水平較治療前明顯下降，且治療6個月后的N-MID水平較治療3個月后也明顯下降（P均＜0.001）。治療后疾病未見緩解或加重組患者的血清N-MID水平較治療前差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 治療后不同療效患者的N-MID表達水平變化Fig.4 Changes of N-MID levels in patients with different therapeutic effects after treatment

3 討 論

以ECT和PET/CT為主的影像學檢查目前仍是肺癌患者骨轉移主要的診斷方法［20］。影像學檢查能夠對骨轉移病灶的部位、數量和大小進行分辨和顯示，但存在費用昂貴、檢測條件苛刻和特異性不高等問題，難以應用于人群篩查、短期多次復查及長期疾病監(jiān)測［21-22］。因此，臨床上仍需探究更高效便捷的骨轉移評估方法。

骨鈣素（osteocalcin，OC）是主要由非增殖期成骨細胞合成并特異性分泌的一種小分子球狀蛋白質［23］。OC的羧化谷氨酸在鈣離子存在的條件下能夠促進其與羥磷灰石結合并沉積于細胞外骨基質，從而促進骨骼發(fā)育，有研究［24-25］表明，OC具有趨化和激活破骨細胞的能力，其羧化末端對破骨細胞的前體有化學誘導作用，進而調節(jié)骨吸收。部分OC會釋放入血，完整的OC在外周血中不穩(wěn)定，經過蛋白酶水解后，血清中約1/3為完整OC，1/3為氨基酸短肽，1/3為裂解后的N-MID［26］。N-MID在血清中具有良好的穩(wěn)定性，能夠反映骨中的OC水平，繼而反映成骨細胞的活性以及骨形成和骨吸收的情況，是一項靈敏度和特異度均較高的骨代謝指標。多項研究［27-29］表明，血清N-MID水平可作為診斷乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤骨轉移的敏感指標，在骨轉移患者中其水平顯著升高。本研究結果顯示，治療前骨轉移組的肺癌患者血清N-MID水平明顯高于無骨轉移組和健康對照組，而無骨轉移組與健康對照組間的N-MID水平差異無統(tǒng)計學意義，表明肺癌患者N-MID水平升高與發(fā)生骨轉移相關。本研究發(fā)現，N-MID（OR=9.265）和NSE（OR=2.688）是肺癌患者發(fā)生骨轉移的危險因素。NSE作為肺癌診斷和監(jiān)測的敏感指標，可提示肺癌患者的臨床分期和疾病進展，在患者發(fā)生骨轉移后易產生波動，而N-MID與骨轉移的相關程度最高。ROC曲線顯示，血清N-MID診斷肺癌患者骨轉移的AUC為0.849，具有較高的診斷價值。以上結果表明，血清N-MID可作為肺癌患者骨轉移輔助診斷的有效指標，這與相關研究［30-32］的結果一致。

在肺癌合并骨轉移患者的治療過程中，對疾病進展和療效的監(jiān)測，以及對預后的評估，是指導臨床選擇合理治療方案，提高患者生活質量的關鍵，也是臨床醫(yī)師關注的重點［33-35］。肺癌骨轉移的臨床治療主要采用含鉑雙藥聯(lián)合化療，同時聯(lián)合雙磷酸鹽治療，必要時應用鎮(zhèn)痛類藥物或放療，唑來膦酸是目前使用最廣泛的雙磷酸鹽類藥物［36-37］。唑來膦酸能夠抑制破骨細胞的成熟和聚集，也可以抑制成熟破骨細胞的活性和功能，從而減少骨吸收，使得因骨轉移而紊亂的骨代謝水平趨于穩(wěn)定［38-39］。因此，通過比較N-MID等骨代謝標志物的濃度變化，可以觀察肺癌患者的療效和預后。本研究通過對療效和預后進行隨訪評估，依據最佳臨界值對患者進行分類，記錄不同血清N-MID水平下患者的PFS，發(fā)現N-MID＞14.96 ng/mL組患者的PFS明顯低于N-MID≤14.96 ng/mL組患者（HR=2.040），說明N-MID水平越高，患者疾病進展越快，預后越差。本研究發(fā)現治療后疾病緩解患者的N-MID水平降低，而疾病未見緩解或加重患者的N-MID水平無明顯變化。由此可見，血清N-MID水平在肺癌合并骨轉移患者的療效監(jiān)測和預后評估中有指導作用。

本研究的局限性在于病例數有限，尤其是肺癌合并骨轉移患者的隨訪例數少，隨訪時間較短，仍有待大樣本前瞻性研究進一步分析血清N-MID水平在患者隨訪中的應用，證實N-MID在肺癌患者骨轉移輔助診斷和療效監(jiān)測方面的作用。