跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)下大鼠脫鈣股骨骨髓適應(yīng)性節(jié)約化和脾臟免疫機(jī)能下降對(duì)B細(xì)胞早期發(fā)育的影響研究

耿青青，田禎祥，張鶴鳴，王 宏，何 偉，劉雙妍

現(xiàn)有運(yùn)動(dòng)免疫學(xué)研究從血液和外周淋巴器官的免疫細(xì)胞入手探索運(yùn)動(dòng)性免疫失衡現(xiàn)象發(fā)生的原因，研究了運(yùn)動(dòng)過程中CD4+/CD8+倒置（陳佩杰 等，2011；Dong et al.，2011；Wang et al.，2011）、Th1/Th2漂移（肖衛(wèi)華 等，2011a，2011b；Wang et al.，2009）等現(xiàn)象，這些問題雖然表現(xiàn)在血液，但根源應(yīng)在中樞淋巴器官骨髓及主要遷移區(qū)次級(jí)淋巴器官脾臟，即運(yùn)動(dòng)應(yīng)激可能會(huì)在B淋巴細(xì)胞發(fā)育的不同階段，通過刺激分化因子、轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控因子（耿青青，2012，2013；耿青青 等，2011），影響B(tài)淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中不同階段性的分化、增殖、發(fā)育和成熟。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性免疫失衡現(xiàn)象的原因非常復(fù)雜，并非單一因素所造成，涉及免疫細(xì)胞之間的相互作用和整合作用（陳佩杰 等，2011；Wang et al.，2009），運(yùn)動(dòng)過程中會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡增多等現(xiàn)象（陳佩杰等，2011；耿青青，2012，2013；耿青青 等，2011；Dong et al.，2011），造成免疫失衡。

本研究遵循以上思路，從B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的源頭骨髓及主要遷移區(qū)次級(jí)淋巴器官脾臟入手，探索B淋巴細(xì)胞受運(yùn)動(dòng)的影響所發(fā)生的數(shù)量和功能的改變，有助于闡明長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的影響以及機(jī)理。

隨著科研人員對(duì)骨髓分子生物學(xué)研究的深入，骨髓與骨微環(huán)境的形態(tài)學(xué)研究技術(shù)也在不斷優(yōu)化，如何使骨髓支架微結(jié)構(gòu)及造血細(xì)胞群更加清晰易辨，這關(guān)系著骨微環(huán)境的重塑在實(shí)驗(yàn)研究中的真實(shí)再現(xiàn)。Liu等（2017）采用振動(dòng)法和低溫法處理樣品，探討了不同脫鈣劑對(duì)骨結(jié)構(gòu)和抗原性的保護(hù)作用，得出10%中性緩沖EDTA和5%硝酸是組化染色的首選脫鈣劑，為制定適宜的大鼠脫鈣股骨骨組織分析方案提供了依據(jù)。

蘇木素-伊紅（H.E.）染色是組織病理學(xué)的主要染色之一，也是醫(yī)學(xué)診斷中應(yīng)用最廣泛的染色之一。Fujii等（2016）選取了5例肺部API2-MALT1融合陽性MALT淋巴瘤進(jìn)行石蠟切片，依次進(jìn)行H.E.染色、CD79a免疫熒光染色等，研究顯示，腫瘤結(jié)構(gòu)可能是對(duì)MALT淋巴瘤進(jìn)行正確組織病理學(xué)診斷的核心因素，H.E.染色、免疫熒光染色等方法是細(xì)胞水平上實(shí)用且有效的病理學(xué)分析工具。

Laakko等（2002）研究在體植入小鼠體內(nèi)相當(dāng)于應(yīng)激下的糖皮質(zhì)激素含量36 h后，用流式細(xì)胞術(shù)方法觀察到淋巴系中的前祖B細(xì)胞減少20%；髓系干細(xì)胞中的粒細(xì)胞系增加了30%，紅細(xì)胞系、單核細(xì)胞系所占的百分比沒有顯著性變化，推測(cè)機(jī)體通過限制骨髓淋巴樣細(xì)胞的發(fā)育以保障機(jī)體的第一線免疫防御體系的能量供應(yīng)。Trottier等（2012）和King等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，飲食導(dǎo)致肥胖的小鼠骨髓中髓系分支和淋巴系分支細(xì)胞均有增強(qiáng)，早期觀察發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)不良時(shí)，尤其是鋅元素缺乏時(shí)，機(jī)體通過減少淋巴系分支的發(fā)育以平衡有限的營養(yǎng)供應(yīng)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)性免疫失衡狀態(tài)下，B細(xì)胞早期發(fā)育中Pro B cell（原B細(xì)胞）階段的細(xì)胞數(shù)量明顯下降，Pre B cell（前B細(xì)胞）階段的細(xì)胞數(shù)量呈非常顯著性下降，不成熟B細(xì)胞呈顯著性下降，成熟B細(xì)胞則呈顯著性上升，提示6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能通過代償機(jī)制，促使增殖池中僅存的少量前B細(xì)胞增殖和分化成為成熟B細(xì)胞，從而適應(yīng)機(jī)體大量運(yùn)動(dòng)耗能的需要，這可能與骨髓中轉(zhuǎn)錄因子E2A、EBF、PAX5因子的表達(dá)相關(guān)（耿青青，2012，2013；耿青青 等，2011）。課題組一方面繼續(xù)從趨化因子如CXCL12、CXCL13、粘附因子、Notch信號(hào)家族等角度探索原因機(jī)制，另一方面，希望從形態(tài)學(xué)上得到B細(xì)胞發(fā)育的中樞器官骨髓和主要遷移區(qū)次級(jí)淋巴器官脾臟的圖像論據(jù)支持。

基于此，本研究在傳統(tǒng)脫鈣股骨骨髓組化技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行改良，利用該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚴构撬柚Ъ芪⒔Y(jié)構(gòu)及造血細(xì)胞群更加清晰易辨的特點(diǎn)，檢測(cè)遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中大鼠股骨骨髓、脾臟的組織結(jié)構(gòu)變化及對(duì)骨髓B細(xì)胞早期發(fā)育的影響。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象分組、采樣與運(yùn)動(dòng)模型

選取64只8周齡雄性SD大鼠，隨機(jī)分為0周、2周、4周和6周組，每周數(shù)組又各分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8只。大鼠進(jìn)行6周遞增強(qiáng)度訓(xùn)練，分別在0周、2周、4周和6周最后一次運(yùn)動(dòng)后48 h（消除上次運(yùn)動(dòng)的影響）采樣，無菌條件下取大鼠股骨和脾臟，有利于觀察隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的遞增，免疫功能所發(fā)生的適應(yīng)性變化。

勻速跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度設(shè)為0，每天訓(xùn)練30 min，每周6天，共6周，經(jīng)過1周的適應(yīng)性訓(xùn)練，第2周20 m/min起，速度每周遞增5 m/min，直至40 m/min。對(duì)照組正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)（耿青青，2012，2013）。

1.2 大鼠脫鈣股骨骨髓石蠟切片的制作及H.E.染色程序

1）股骨骨髓石蠟塊取材：在各采樣點(diǎn)無菌取出大鼠的一側(cè)股骨，迅速放入10%中性甲醛液中固定24 h，4℃10% EDTANa2脫鈣，搖床，每3天換液1次，1.5～2.0個(gè)月后，針刺無阻即判斷為脫鈣完成。用流動(dòng)水沖洗8 h，取股骨骨干和股骨頭的結(jié)合部備用；2）脫水：60%乙醇1 h，70%、80%、90%、95%乙醇各2 h，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1 h；3）透明：正丁醇Ⅰ、Ⅱ依次各8 h和16 h。4）浸蠟：入蠟Ⅰ、Ⅱ各2 h，浸蠟溫度63℃～65℃，不得高于70℃；5）包埋：將組織放入包埋盒內(nèi)，注入融化的石蠟，寫上標(biāo)簽；6）切片：2～3 μm厚度連續(xù)切片；7）烤片：1.5 h，65℃；8）脫蠟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次各10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、95%、90%、80%、70%乙醇依次各1～2 min，水洗3 min，蒸餾水30 s；9）蘇木素染色1～2 min；10）流水沖洗反藍(lán)，蒸餾水洗；11）伊紅染色1～3 s，在鏡下控制分色程度，至細(xì)胞著色分明；12）蒸餾水速洗，吸水紙吸干；13）入95%乙醇分色1 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 大鼠脾臟石蠟切片的制作及H.E.染色程序

由于脾臟本身質(zhì)地的原因，脾臟在固定液內(nèi)固定后，若實(shí)驗(yàn)試劑配制濃度及反應(yīng)時(shí)間控制不當(dāng)，極易引起固定后的脾臟變脆，導(dǎo)致切片標(biāo)本有裂痕，甚至有脫片現(xiàn)象。

本研究將此方法改良，有效提高了制片的成功率：1）取材，4%甲醛固定24 h，流水沖洗8 h，切割成1～1.5 cm小塊備用；2）脫水：60%乙醇1 h，70%乙醇和80%乙醇各2 h，95% 乙醇 27 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ依次各9 min，7 min；3）透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次各9 min，7 min；4）浸蠟：入蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ依次各 16 min，18 min，20 min（浸蠟溫度 63℃～64℃）；5）包埋：做成蠟塊，寫上標(biāo)簽；6）切片：2～3 μm的厚度；7）烤片：1.5 h，65℃；8）脫蠟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各9 min，10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、95%乙醇各2 min，80%乙醇1 min，水洗3 min，蒸餾水30 s；9）～13）同脫鈣股骨骨髓切片染色程序。

1.4 脫鈣股骨骨髓、脾臟石蠟切片形態(tài)學(xué)觀察

隨機(jī)選取5個(gè)視野/切片，Image-pro PLUS 6.0圖像分析。骨髓H.E.切片觀察骨髓支架結(jié)構(gòu)與造血細(xì)胞群；脾臟H.E.切片觀察紅髓、白髓、脾小結(jié)結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，通過單因素方差分析，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量變化

各組大鼠體質(zhì)量均有增長(zhǎng)，均高于0周對(duì)照組，但各組間無顯著性變化（P＞0.05，表1）。

表1 大鼠體質(zhì)量變化Table 1 Changes of Weights of Rats g

2.2 大鼠脾臟系數(shù)變化

與0周運(yùn)動(dòng)組相比，2周運(yùn)動(dòng)組呈非常顯著性下降（P＜0.01），4周運(yùn)動(dòng)組和6周運(yùn)動(dòng)組均呈顯著性下降（P＜0.05）；對(duì)照組各組間無顯著性差異（P＞0.05），排除了生長(zhǎng)發(fā)育因素的影響（表2）。

表2 大鼠脾臟系數(shù)變化Table 2 Changes of Spleen Index of Rats

2.3 大鼠脫鈣股骨骨髓組織結(jié)構(gòu)的變化

在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中，0周運(yùn)動(dòng)組大鼠骨髓造血組織結(jié)構(gòu)完整，造血細(xì)胞豐富，細(xì)胞群分布均勻，無分布定位異常。與0周運(yùn)動(dòng)組相比，2周運(yùn)動(dòng)組骨髓支架結(jié)構(gòu)中造血細(xì)胞呈減少趨勢(shì)。與2周運(yùn)動(dòng)組相比，4周運(yùn)動(dòng)組骨髓支架結(jié)構(gòu)中造血細(xì)胞有增加趨勢(shì)。與4周運(yùn)動(dòng)組相比，6周運(yùn)動(dòng)組骨髓支架結(jié)構(gòu)中造血細(xì)胞有繼續(xù)增加趨勢(shì)，同時(shí)，與0周運(yùn)動(dòng)組相比，6周運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞數(shù)量有增多趨勢(shì)（圖1）。脫鈣股骨骨髓石蠟切片半定量（吳迪等，2018）分析表明：骨髓網(wǎng)狀纖維化病理分級(jí)各組均為0級(jí)，未出現(xiàn)1級(jí)、2級(jí)和3級(jí)；骨髓造血細(xì)胞病理分級(jí)各組均為-級(jí)，各組造血細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻，造血組織結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)病理+級(jí)，甚至++級(jí)和+++級(jí)。

圖1 各周運(yùn)動(dòng)組大鼠脫鈣股骨骨髓石蠟切片H.E.染色圖（40×10倍）Figure 1. H.E.of Paraffin Section of Decalcified Femur Bone Marrow in Exercise Group

2.4 大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的變化

顯微鏡下可見大鼠脾臟被膜、紅髓、白髓和脾小結(jié)。大鼠脾臟被膜較薄。白髓H.E.染色呈紫色，紅髓呈粉紅色。白髓中央或一側(cè)有中央動(dòng)脈。當(dāng)白髓結(jié)構(gòu)完整典型時(shí)，脾小結(jié)清晰可見，大小不一，形狀各不相同。紅髓內(nèi)還可見許多紅細(xì)胞。

在0周運(yùn)動(dòng)組，白髓和紅髓之間界線清楚，脾小結(jié)比較明顯；2周運(yùn)動(dòng)組白髓和紅髓之間界線不清晰，脾小結(jié)模糊；4周運(yùn)動(dòng)組仍呈現(xiàn)白髓和紅髓界線交叉現(xiàn)象，界線模糊，白髓開始呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，脾小結(jié)模糊不清；6周運(yùn)動(dòng)組，白髓結(jié)構(gòu)相對(duì)比較集中，但出現(xiàn)紅髓浸潤到白髓結(jié)構(gòu)中的現(xiàn)象，脾小結(jié)模糊（圖2）。H.E.染色半定量（劉玲玲等，2012）分析表明，0周、2周、4周和6周的脾組織病理分級(jí)分別為-、+、+、-，尚未出現(xiàn)病理++級(jí)和+++級(jí)。

圖2 各周運(yùn)動(dòng)組大鼠脾臟H.E.染色圖（40×10倍）Figure 2. H.E.of Spleen in Exercise Group

3 分析與討論

3.1 長(zhǎng)期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中骨髓切片結(jié)構(gòu)的改變

功能的變化源于結(jié)構(gòu)的變化。骨髓和脾臟這兩個(gè)重要的B細(xì)胞發(fā)育中樞和主要遷移區(qū)次級(jí)淋巴器官，維持其正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)是保障免疫功能正常運(yùn)作的前提和先決條件。鑒于此，觀察6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中大鼠骨髓和脾臟結(jié)構(gòu)的變化，研究其對(duì)B淋巴細(xì)胞發(fā)育早期的影響，對(duì)于揭示運(yùn)動(dòng)性免疫失衡機(jī)制具有重要意義。

本研究遵循這個(gè)思路，從B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的源頭骨髓和次級(jí)淋巴器官脾臟，探索B淋巴細(xì)胞受運(yùn)動(dòng)的影響所發(fā)生的數(shù)量、功能的改變，不僅有助于闡明長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的影響以及機(jī)理，還為運(yùn)動(dòng)性免疫失衡的調(diào)理提供新的方法、思路和圖像依據(jù)。

本研究采用的脫鈣股骨骨髓組化技術(shù)鮮見報(bào)道，與骨髓涂片相比，該方法可以使骨髓支架微結(jié)構(gòu)及造血細(xì)胞群更加清晰易辨，更利于髓內(nèi)組織構(gòu)形的保存（Clay-combe et al.，2016；Hardy et al.，2012）。因?yàn)槊撯}是骨組織病理學(xué)觀察和含骨組織（Ma et al.，2016）的重要步驟，目前脫鈣方法普遍操作繁瑣，因此，樣品的脫鈣處理環(huán)節(jié)對(duì)骨微環(huán)境重塑的真實(shí)再現(xiàn)至關(guān)重要。本研究采用4℃低溫處理、10%EDTANa2低脫鈣溶液和搖床方式連續(xù)性地晃動(dòng)樣品，有助于高效脫鈣和保存石蠟包埋切片樣品的組織結(jié)構(gòu)和抗原性（圖1）。

骨髓是造血組織，也是各類免疫細(xì)胞的發(fā)生場(chǎng)所。骨髓中含有骨髓基質(zhì)細(xì)胞（stromal cell）和造血干細(xì)胞（hematopoietic steam cells，HSC）（Abdelrasoul et al.，2018）。HSC具有多種分化潛能，因此又稱多能HSC（plu-ripotent HSC）。出生后以及整個(gè)成年期，多能HSC一般僅見于骨髓。多能HSC分為淋巴樣干細(xì)胞（lymphoid stem cell）和髓樣干細(xì)胞（myeloid stem cell）兩大類。髓樣干細(xì)胞可繼續(xù)分化為具有產(chǎn)生粒細(xì)胞系、紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系和單核-吞噬細(xì)胞系潛能的集落形成單位CFU-GEMM（Abdelrasoul et al.，2018）。淋巴樣干細(xì)胞可繼續(xù)分化為B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞，在此過程中，有眾多轉(zhuǎn)錄因子（如EBF）、細(xì)胞分化因子（如IL-7）、趨化生長(zhǎng)因子（如CX-CL-12）、Notch信號(hào)家族等參與調(diào)控，它們啟動(dòng)不同譜系特異基因的表達(dá)，以確保淋巴樣干細(xì)胞向某一譜系（如B淋巴細(xì)胞）分化時(shí)，也將失去向其他譜系分化的潛能。淋巴樣干細(xì)胞中的一部分在骨髓內(nèi)繼續(xù)分化成B細(xì)胞，主要包括前祖B細(xì)胞（pre-pro B cell）、原（祖）B細(xì)胞（pro-B cell）、前B（祖）細(xì)胞（pre-B cell）、不成熟B細(xì)胞（immature B）、成熟B細(xì)胞（mature B）。B淋巴細(xì)胞大約在骨髓發(fā)育20 d成熟時(shí)穿過血竇壁進(jìn)入血流。其遷出骨髓，先進(jìn)入脾臟，往往在脾臟接觸抗原后再遷移到其他次級(jí)淋巴器官（Abdelrasoul et al.，2018）。

運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫軸會(huì)發(fā)生變化，抵抗或適應(yīng)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激，免疫系統(tǒng)也會(huì)發(fā)生變化，最終使機(jī)體盡可能保持相對(duì)平衡的內(nèi)穩(wěn)態(tài)（Dela et al.，2016；Radom et al.，2016；Yamanaka et al.，2010）。中樞骨髓造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞等幼稚細(xì)胞和造血調(diào)控因子的改變，會(huì)引發(fā)外周血細(xì)胞形態(tài)、功能和數(shù)量改變，而免疫細(xì)胞數(shù)量的變化則可反映免疫失衡的發(fā)展進(jìn)程和嚴(yán)重程度。骨髓造血微環(huán)境中細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間以及細(xì)胞與細(xì)胞因子之間的相互作用，造血細(xì)胞自我更新與分化之間的平衡，精確地調(diào)控著骨髓中免疫細(xì)胞的損傷與修復(fù)（浦權(quán)，2002）。骨髓作為中樞淋巴器官，為免疫細(xì)胞提供了適宜存活和增殖的微環(huán)境，研究脫鈣股骨骨髓形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)于了解機(jī)體的B細(xì)胞早期發(fā)育具有重大參考價(jià)值。

本研究通過觀察脫鈣股骨骨髓石蠟包埋組織切片發(fā)現(xiàn)，2周運(yùn)動(dòng)組骨髓造血細(xì)胞數(shù)量呈減少趨勢(shì)，可能是機(jī)體受到驟然升高的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，機(jī)體免疫機(jī)能保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)過度而產(chǎn)生；4周、6周運(yùn)動(dòng)組造血細(xì)胞呈增加趨勢(shì)，可能是骨髓髓系干細(xì)胞在隨著訓(xùn)練周數(shù)的遞進(jìn)，對(duì)遞增的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度有了更加節(jié)約化的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。由于機(jī)體營養(yǎng)供應(yīng)分配有優(yōu)先等次之分，會(huì)引起骨髓髓系與淋巴系細(xì)胞增殖情況發(fā)生變化（King et al.，2002；Laakko et al.，2002；Trottier et al.，2012）：骨髓增殖池中髓系干細(xì)胞的數(shù)量變化影響著淋巴系細(xì)胞凋亡的數(shù)量變化以及增殖情況的抑制或促進(jìn)。這些骨髓造血微環(huán)境的改變一定會(huì)影響B(tài)淋巴細(xì)胞在骨髓的早期分化與發(fā)育（耿青青，2012，2013；耿青青 等，2011）。

已有研究表明（盧興國，2008），免疫失衡狀態(tài)下，骨髓各造血細(xì)胞所受影響各不相同，細(xì)胞的半衰期越短越易受影響而發(fā)生凋亡。白細(xì)胞的半衰期為6 h，血小板5～7天，紅細(xì)胞則長(zhǎng)至127天，因此白細(xì)胞受影響最大，特別是粒細(xì)胞減少最為明顯，即白細(xì)胞數(shù)量對(duì)骨髓造血微環(huán)境的變化更為敏感。研究還發(fā)現(xiàn)，骨髓中B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少不僅是因?yàn)榘l(fā)育中細(xì)胞數(shù)量的減少，還與存活細(xì)胞增殖能力的減弱有關(guān)（Nunez et al.，1990；Juan et al.，2011）。Laakko等（2002）模擬了運(yùn)動(dòng)應(yīng)激下的體內(nèi)皮質(zhì)酮（corticosterone），不僅造成小鼠骨髓中原B細(xì)胞、前B細(xì)胞的數(shù)量百分比大幅下降，且存活下來的原B細(xì)胞和前B細(xì)胞的增殖能力也會(huì)急劇下降。

3.2 長(zhǎng)期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中脾指數(shù)與脾臟微結(jié)構(gòu)的改變

脾是機(jī)體最大的外周淋巴器官，具有濾血和產(chǎn)生免疫應(yīng)答等重要功能。白髓是一個(gè)密集的淋巴組織，分布在中央靜脈周圍，由動(dòng)脈周圍淋巴鞘和脾小結(jié)組成。動(dòng)脈周圍淋巴鞘由大量T細(xì)胞等組成，是脾臟中的胸腺依賴區(qū)，當(dāng)發(fā)生免疫應(yīng)答時(shí)，此區(qū)明顯增厚（成令忠，2003）。脾小結(jié)主要由B細(xì)胞組成。紅髓由脾索和脾血竇組成。白髓結(jié)構(gòu)典型與否和機(jī)體受到的抗原刺激有關(guān)。隨著抗原刺激的不斷增加，免疫反應(yīng)不斷增強(qiáng)，脾小結(jié)中含有活躍的B細(xì)胞，移行區(qū)則被用作脾臟與血液淋巴細(xì)胞再循環(huán)的通道，其在動(dòng)員具有免疫活性的淋巴細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用。隨著白髓與紅髓界線漸漸模糊，白髓比例降低，脾小結(jié)逐漸不明顯，預(yù)示著免疫能力逐漸下降，因此，脾臟的組織學(xué)變化代表了機(jī)體免疫功能的改變。

脾也是機(jī)體發(fā)生免疫功能的重要場(chǎng)所，脾指數(shù)的高低在一定程度上反映了身體免疫機(jī)能的強(qiáng)弱。本文同時(shí)檢測(cè)了脾指數(shù)和脾臟切片H.E.染色兩項(xiàng)指標(biāo)，既可以相互補(bǔ)充，又可以相互論證：脾臟切片顯示，從2周運(yùn)動(dòng)組開始出現(xiàn)白髓和紅髓之間界線交叉現(xiàn)象；6周運(yùn)動(dòng)組，出現(xiàn)了紅髓浸潤到白髓結(jié)構(gòu)中的現(xiàn)象；與0周運(yùn)動(dòng)組相比，脾指數(shù)在2周運(yùn)動(dòng)組呈非常顯著性下降，4周運(yùn)動(dòng)組和6周運(yùn)動(dòng)組呈顯著性下降。

綜上，提示脾臟免疫機(jī)能下降，推測(cè)可能是在訓(xùn)練進(jìn)程的第2周，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷驟升，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)此“不適應(yīng)”應(yīng)激，產(chǎn)生了一種過表達(dá)方式的應(yīng)答初反應(yīng)。4周和6周，在運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的不斷遞加的情況下，伴隨著運(yùn)動(dòng)性疲勞的累積等，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過多活性氧，這會(huì)對(duì)淋巴細(xì)胞DNA造成損傷，改變淋巴細(xì)胞的生物學(xué)活性，如削弱細(xì)胞的增殖能力，分泌功能等，也會(huì)加速免疫細(xì)胞的凋亡甚至死亡（陳佩杰 等，2011；耿青青，2013；耿青青 等，2011），可能會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)外周肌肉組織炎性因子浸潤的發(fā)生（陳佩杰 等，2011）。

脾臟和淋巴結(jié)都是機(jī)體的外周免疫器官，是成熟T細(xì)胞和B細(xì)胞駐留、增殖以及對(duì)抗原刺激作出反應(yīng)的場(chǎng)所，這些器官富含捕捉和處理抗原的巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，后者又能迅速捕獲和處理抗原，并將處理后的抗原遞呈給免疫活性細(xì)胞，主要是T細(xì)胞和B細(xì)胞。T細(xì)胞和B細(xì)胞經(jīng)骨髓分化發(fā)育成熟后，經(jīng)血液循環(huán)分布到外周免疫器官。B細(xì)胞主要分布在脾臟的脾小結(jié)、脾索和脾淋巴鞘外周，以及淋巴結(jié)的淋巴小結(jié)、髓索和胃腸道黏膜下的淋巴小結(jié)中（陳海英，2008）。本研究通過觀察脾臟組織切片可知，由2周組紅髓和白髓界限不清，到6周組紅髓與白髓有浸潤現(xiàn)象發(fā)生，提示遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)應(yīng)激下，大鼠脾臟B淋巴細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢(shì)。有研究顯示，脾臟淋巴細(xì)胞的大量凋亡必然導(dǎo)致免疫細(xì)胞的損耗以及凋亡細(xì)胞本身所產(chǎn)生對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制（Kennedy et al.，2017），這將進(jìn)一步削弱脾臟B細(xì)胞的增殖能力，加速脾臟B細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致脾臟免疫機(jī)能下降。

骨髓作為中樞淋巴器官，脾臟作為次級(jí)淋巴器官，對(duì)比表明，與骨髓微環(huán)境相比，脾臟微結(jié)構(gòu)發(fā)生的免疫反應(yīng)對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激更為敏感，其變化也比骨髓更加明顯；兩者適應(yīng)性反應(yīng)也各不相同。這些組織微結(jié)構(gòu)的變化為運(yùn)動(dòng)性免疫失衡的分子生物學(xué)討論（圖3）提供了有力的圖像論證支持，奠定了組織學(xué)基礎(chǔ)。

圖3 實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)在2周組的變化及相互關(guān)聯(lián)Figure 3. Changes and Correlations of Indexes in 2-Week Group

4 小結(jié)

與0周運(yùn)動(dòng)組相比，2周運(yùn)動(dòng)組脫鈣股骨骨髓造血細(xì)胞呈下降趨勢(shì)，4周組和6周組呈上升趨勢(shì)，推測(cè)：隨著訓(xùn)練周數(shù)的推進(jìn)，骨髓中淋巴系干細(xì)胞與髓系干細(xì)胞生發(fā)比例會(huì)發(fā)生改變，因?yàn)闄C(jī)體營養(yǎng)供應(yīng)，對(duì)于髓系與淋巴系的分配是不同步且有優(yōu)先等次之分，那么骨髓增殖池中髓系干細(xì)胞的數(shù)量變化，影響著淋巴系細(xì)胞的凋亡和增殖情況，進(jìn)而影響B(tài)淋巴細(xì)胞在骨髓的早期發(fā)育。

從2周運(yùn)動(dòng)組開始出現(xiàn)白髓和紅髓之間界線交叉現(xiàn)象，同時(shí)脾指數(shù)明顯下降，提示脾臟免疫機(jī)能下降，可能是伴隨著運(yùn)動(dòng)性疲勞的累積，削弱了脾臟免疫細(xì)胞的增殖與活化能力，進(jìn)而影響了B淋巴細(xì)胞在脾臟的進(jìn)一步分化與發(fā)育。

綜上，提示與骨髓微環(huán)境相比，脾臟微結(jié)構(gòu)的免疫反應(yīng)對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激更為敏感，其變化比骨髓更加明顯；兩者適應(yīng)性反應(yīng)大不相同。