全緣葉綠絨蒿總黃酮和總生物堿的提取工藝研究

余迎香，王 巖，劉明珠，暨迪軍，盧永昌，2

（1.青海民族大學(xué) 藥學(xué)院/青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；2.青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，青海 西寧 810007）

全緣葉綠絨蒿［Meconopsis integrifolia(Maxim.)Franch.］屬于罌粟科綠絨蒿屬植物，1年至多年生草本植物。生長于高海拔地區(qū)的灌木叢或者樹林下，分布于我國甘肅、青海、云南、四川、西藏等地[1-2]。全緣葉綠絨蒿為藏藥材的一種，具有抗疲勞、抗氧化、止痛和保肝作用，還可治療皮膚病[3-4]。全緣葉綠絨蒿含有生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油等成分[5-6]，其中，生物堿和黃酮類為主要成分。生物堿多具有藥物活性，為藥用植物有效成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[7]。黃酮是一類含有氧雜環(huán)的化合物，多存在高等植物及蕨類植物中，具有抗氧化和抗炎功效，并能減緩腫瘤形成[8]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)所用儀器：可見分光光度計(jì)（722E，上海光譜儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6，金壇市杰瑞爾電器有限公司）、循環(huán)水式多用真空泵（SHB-B88，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA-N1100，上海愛明儀器有限公司）、電子天平（ME2353，北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)所用試劑：罌粟堿對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號：171214-201205）、蘆丁對照品（都萊生物有限公司，批號：N1811260038），硝酸鋁、亞硝酸鈉、95%乙醇、氫氧化鈉均為分析純。

1.3 供試材料

全緣葉綠絨蒿于2018年8月采自于青海省玉樹市，經(jīng)青海民族大學(xué)盧永昌教授鑒定為罌粟科綠絨蒿屬全緣葉綠絨蒿，標(biāo)本存于青海民族大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 總黃酮的提取工藝優(yōu)化

1.4.1.1 對照品溶液制備 稱取蘆丁對照品10 mg，用60%乙醇100 mL溶解，得到0.1 mg/mL的對照品溶液，備用。

1.4.1.2 供試品溶液制備 在圓底燒瓶中加入1.0 g全緣葉綠絨蒿粗粉，再加入25 mL 60%乙醇，稱量總質(zhì)量?；亓魈崛?.5 h，再次稱量總質(zhì)量，并用60%乙醇補(bǔ)至25 mL，過濾后得到供試品溶液。

1.4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取6支10 mL容量瓶分別加入蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，然后用60%乙醇定容至刻度，得到0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的對照品溶液。分別取上述用60%乙醇定容后的不同質(zhì)量濃度的對照品溶液2.0 mL至25 mL容量瓶中，再加入5%硝酸鈉、10%硝酸鋁溶液各1.0 mL，充分振蕩后靜置10 min。待混合液混合均勻后，加入60%乙醇定容，測定其吸光度[9]。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：A=2.946 4C+ 0.007 1，r=0.999 8。

1.4.1.4 單因素試驗(yàn)考察 乙醇的體積分?jǐn)?shù)對全緣葉綠絨蒿總黃酮提取的影響：取6個(gè)圓底燒瓶，分別加入全緣葉綠絨蒿粗粉1.0 g，再分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，回流2 h，之后用1.4.1.3中的方法測定其含量。

提取時(shí)間對全緣葉綠絨蒿總黃酮提取的影響：取5個(gè)圓底燒瓶，精確加入全緣葉綠絨蒿粗粉1.0 g，用60%乙醇進(jìn)行回流提取。提取時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，用1.4.1.3中的方法測定含量。

液料比對全緣葉綠絨蒿總黃酮提取影響：在4個(gè)圓底燒瓶中精確加入全緣葉綠絨蒿粗粉1.0 g，用60%乙醇回流提取，液料比分別為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，用1.4.1.3中的方法測定其含量。

1.4.1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1—2。

表1 響應(yīng)面法水平設(shè)計(jì)

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果分析

1.4.2 總生物堿的提取工藝優(yōu)化

1.4.2.1 對照品溶液制備 稱取罌粟堿對照品30 mg，加0.1 mol/L鹽酸溶液100 mL溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.3 mg/ mL的鹽酸罌粟堿溶液。

1.4.2.2 供試品溶液制備 在錐形瓶中加入已經(jīng)稱量好的2.0 g全緣葉綠絨蒿粗粉，加入10 mL濃氨水進(jìn)行堿化處理。再加入50 mL無水乙醇，充分超聲混合后，將濾液水浴蒸干，待殘?jiān)名}酸溶解后即成。

1.4.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取6支250 mL分液漏斗，分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL對照品溶液。繼續(xù)加入5.0 mL醋酸鹽溶液、2.0 mL溴甲酚溶液，混合均勻后再加入20 mL氯仿溶液，振蕩后靜置2 h。取氯仿層在416 nm下測定吸光度[10]。以吸光度A為縱坐標(biāo)，罌粟堿質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：A=1.700 8C+0.010 3，r=0.998 0。

1.4.2.4 單因素法提取總生物堿 （1）不同功率對生物堿提取的影響：在錐形瓶中加入2.0 g全緣葉綠絨蒿粗粉，量取10 mL濃氨水堿化處理，攪拌使其混合均勻，靜置30 min。加入60 mL無水乙醇，分別以不同功率的微波（60、90、120、150 W）回流提取2 h。再將提取液進(jìn)行水浴蒸干，用0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解，按1.4.2.3中的方法測定含量。（2）溫度對生物堿提取的影響：在4 個(gè)250 mL圓底燒瓶中分別加入2.0 g全緣葉綠絨蒿粗粉，量取10 mL濃氨水堿化處理，攪拌使其混合均勻。設(shè)置溫度分別為40、60、80、100 ℃，加入50 mL無水乙醇回流提取2 h，最后將提取液水浴蒸干，用0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解后，按1.4.2.3中的方法測定含量。（3）液料比對總生物堿提取的影響：在錐形瓶中加入2.0 g全緣葉綠絨蒿粗粉，量取10 mL濃氨水堿化處理，攪拌使其混合均勻。分別加入20、40、60、80 mL的無水乙醇，浸泡5 h后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮乙醇溶液。最后將濃縮液進(jìn)行水浴蒸干，用0.1 mol/ L的鹽酸溶液溶解后，按1.4.2.3中的方法測定含量。

1.4.2.5 正交試驗(yàn)法優(yōu)化試驗(yàn) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)數(shù)據(jù)見表3。

表3 正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析 由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%時(shí)全緣葉綠絨蒿總黃酮含量最低，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高總黃酮含量快速上升，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%總黃酮含量最高，達(dá)0.113 mg/g。之后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高總黃酮含量逐漸下降，因此，最適宜提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。提取時(shí)間為1.0 h時(shí)總黃酮含量最低，隨著提取時(shí)間的延長總黃酮含量快速上升，提取時(shí)間在2.0 h時(shí)總黃酮含量最高，達(dá)0.118 mg/ g。之后，隨著提取時(shí)間的延長總黃酮含量逐漸下降，因此，最適宜的提取時(shí)間為2.0 h。液料比為20∶1（mL∶g）時(shí)全緣葉綠絨蒿總黃酮含量最低，隨著液料比的提高總黃酮含量快速上升，液料比為30∶1（mL∶g）時(shí)總黃酮含量最高，達(dá)0.119 mg/g。之后，隨著液料比的升高總黃酮含量逐漸下降，因此，最適宜提取的液料比為30∶1（mL∶g）。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間及液料比對全緣葉綠絨蒿總黃酮含量的影響

2.1.2 響應(yīng)面方法與預(yù)試驗(yàn)結(jié)果分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，以總黃酮提取量為響應(yīng)值，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合后，得到回歸方程：

式中，Y為總黃酮提取量，A為乙醇體積分?jǐn)?shù)，B為液料比、C為提取時(shí)間。擬合結(jié)果表明，最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為61%，液料比為25∶1（mL∶g），提取時(shí)間為1.56 h，提取量為0.123 mg/g。模型F值為4.820，失擬項(xiàng)F為1.880，P（0.365 4）>0.05（表4），差異未達(dá)到顯著水平，表明模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)匹配，實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果較客觀。影響全緣葉綠絨蒿總黃酮提取含量順序：乙醇體積分?jǐn)?shù)（34.180，0.002 1）＞提取時(shí)間（7.490，0.040 9） ＞液料比（4.210，0.095 3）。綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與二次多項(xiàng)式回歸擬合結(jié)果，最適宜的全緣葉綠絨蒿中總黃酮的提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比25∶1（mL∶g）、提取時(shí)間1.5 h。此時(shí)，黃酮提取量最高，為0.123 mg/g。

表4 全緣葉綠絨蒿總黃酮含量回歸方程方差分析

2.2 總生物堿試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖2可知，隨著超聲功率的提高，全緣葉綠絨蒿總生物堿含量呈升高又下降的趨勢，超聲功率為120 W時(shí)總生物堿含量最高，達(dá)1.342 mg/g。因此，最適宜的總生物堿提取功率為120 W。提取溫度對全緣葉綠絨蒿總生物堿提取影響較大，40 ℃時(shí)提取量較低，60 ℃時(shí)提取量最高，達(dá)1.145 mg/g。當(dāng)提取溫度繼續(xù)提高時(shí)，總生物堿含量反而有所降低。因此，最適宜的總生物堿提取溫度為60 ℃。當(dāng)液料比由10∶1（mL∶g）增加到30∶1（mL∶g）時(shí)，全緣葉綠絨蒿總生物堿含量提升較大，達(dá)1.126 mg/g。繼續(xù)增加液料比時(shí)，總生物堿反而有所下降。因此，最適宜的總生物堿提取的液料比為30∶1。

圖2 提取功率、提取溫度、液料比對全緣葉綠絨蒿總生物堿含量的影響

由圖2、表5可知，在功率為120 W、溫度為40 ℃、料液比為30∶1時(shí)有最佳提取工藝。

表5 正交試驗(yàn)法試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用回流提取方法提取全緣葉綠絨蒿總生物堿，影響最大的因素為超聲功率，其次為反應(yīng)溫度，最后為液料比。在功率為120 W、溫度為40 ℃、液料比為30∶1（mL∶g）時(shí)產(chǎn)生最佳提取工藝，此時(shí)，總生物堿提取量為0.81 mg/g。最適宜的全緣葉綠絨蒿中總黃酮的提取條件：提取溫度乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比25∶1（mL∶g）、提取時(shí)間1.5 h，此時(shí)總黃酮提取量為0.123 mg/g。