陳艾霖，劉 璐，宋春勇，馮 瑞，洪鵬志,2，周春霞,2，林玉鋒

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院// 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室// 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江，524088；2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江），廣東 湛江，524025）

乳液一般由連續(xù)相、分散相和乳化劑三部分組成，是兩種互不相溶的液體混合，需要借助乳化劑形成均勻的分散體[1]。蛋白質(zhì)對(duì)環(huán)境污染小，可再生且具有表面活性，一般作為可食用乳化劑廣泛應(yīng)用在食品加工中[2]。常用的蛋白質(zhì)乳化劑主要包括乳蛋白[3-4]和植物蛋白[5-6]。與陸地植物蛋白和乳蛋白相比，魚(yú)類(lèi)蛋白具有必需氨基酸種類(lèi)齊全、比例均衡、消化吸收率高等優(yōu)點(diǎn)[7]。有研究表明，魚(yú)類(lèi)蛋白能夠阻止油滴絮凝和抑制乳液脂質(zhì)氧化，可作為一種潛在的乳化劑[8]。目前對(duì)羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）的研究主要集中在魚(yú)片冷凍貯藏[9]和干燥[10]、蛋白的提取和性質(zhì)改善[11]以及魚(yú)糜凝膠特性[12]等方面，其分離蛋白作為乳化劑在實(shí)際應(yīng)用中極少，主要與羅非魚(yú)分離蛋白分子量大、溶解度較低以及穩(wěn)定性差、加工貯藏過(guò)程中極易發(fā)生變性[13]有關(guān)。

蛋白質(zhì)乳液穩(wěn)定性受多種pH 值、離子強(qiáng)度和加工條件等[14]因素影響。熱處理是食品加工過(guò)程必不可少的手段，中性條件下的食品乳液必須經(jīng)過(guò)熱處理，才能獲得相應(yīng)的保質(zhì)期[15]。研究表明，熱處理能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子具有更靈活的界面構(gòu)象和較高的游離巰基基團(tuán)[16]。30 ℃和50 ℃熱處理使大豆油脂體乳液表面蛋白分子部分疏水性基團(tuán)暴露，提高油脂體表面蛋白在油-水界面的吸附，增加乳液的界面強(qiáng)度[17]。Ma 等[2]發(fā)現(xiàn)熱處理能促進(jìn)鱈（Gadus macrocephalus）魚(yú)蛋白的界面吸附，使乳液粒徑減小，乳化性能改善。周春霞等[11]通過(guò)添加十二烷基硫酸鈉，發(fā)現(xiàn)靜電和疏水相互作用結(jié)合導(dǎo)致肌球蛋白纖絲解離，可改善低離子強(qiáng)度下肌球蛋白的熱聚集。劉慧清[18]發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)分離蛋白（tilapia protein isolate，TPI）在堿性條件下也可以乳化花生油制備穩(wěn)定的乳液。目前國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有關(guān)于熱處理是否可以改善TPI 乳液穩(wěn)定性的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以TPI 為乳化劑，通過(guò)高壓均質(zhì)制備O/W 型TPI乳液，探討熱處理（60～ 90 ℃，30 min）對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響，為制備穩(wěn)定的魚(yú)蛋白乳液及熱處理在乳液食品體系中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要的實(shí)驗(yàn)材料 羅非魚(yú)，湛江東風(fēng)市場(chǎng)；玉米油，益海嘉里有限公司；尼羅紅，上海麥克林生化科技有限公司；尼羅藍(lán)，SIGMA 試劑公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2主要儀器設(shè)備 Avanti J-26sxp 落地高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Beckman 公司；VAP-450 自動(dòng)凱氏定氮儀：德國(guó)Gerhardf 公司；ALPHA1-2LD plus冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen 公司；高壓納米均質(zhì)機(jī)：加拿大ATS 儀器公司；DF-101S 恒溫水浴鍋：河南省予華儀器有限公司；NanoBrook Omni 激光粒度及zeta 電位儀：美國(guó)布魯克海文儀器公司；MARSIII模塊化高級(jí)流變儀：Thermo 儀器公司；FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡：奧林巴斯儀器公司。

1.2 方法

1.2.1TPI 的提取 取鮮活羅非魚(yú)背部白肉絞碎，按照質(zhì)量比1∶9 與冰蒸餾水混合，用勻漿機(jī)攪拌3 min，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至11.0，磁力攪拌提取15 min 后離心（10 000 r/min、20 min、4 ℃）。將離心后的上清液通過(guò)8 層紗布過(guò)濾，過(guò)濾后的濾液用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)過(guò)濾液pH 值至5.5，再離心（10 000 r/min、20 min、4 ℃）。用冰蒸餾水分散離心所得的蛋白沉淀，pH 值調(diào)至7.0，透析后冷凍干燥成蛋白粉末備用。參考GB5009.5-2016 測(cè)TPI的粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（96.05±0.76）%。

1.2.2乳液的制備 將TPI 粉末分散到冰蒸餾水中配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的溶液，冰水浴下用磁力攪拌器攪拌2 h 使之完全溶解，調(diào)整TPI 溶液的pH 為7.0。將TPI 蛋白溶液與玉米油按質(zhì)量比9∶1 比例混合，12 000 r/min 高速剪切2 min 獲得粗乳液。粗乳液于60 MPa、4 ℃高壓均質(zhì)5 次獲得細(xì)乳液。新制備的乳液分別置于60、70、80、90 ℃的水浴鍋，放進(jìn)水浴鍋后計(jì)時(shí)加熱30 min，冷卻至室溫，對(duì)照組不加熱，所有樣品儲(chǔ)藏存于4 ℃進(jìn)行乳液穩(wěn)定性測(cè)定。

1.2.3粒徑和電位的測(cè)定 將新鮮制備的乳液稀釋300 倍避免多重散射，利用激光粒度及zeta 電位儀測(cè)定不同溫度處理后乳液的粒徑和電位。TPI 乳液于4 ℃貯藏28 d，每7 d 取樣測(cè)定其平均粒徑。

1.2.4黏度的測(cè)定 取2 mL TPI 乳液于間隔為1 mm、探頭型號(hào)P35TiL、直徑60 mm 的平行板上，溫度設(shè)定在25 ℃，測(cè)定0.1～ 100 s-1的剪切速率對(duì)乳液的黏度影響，記錄乳液的初始黏度。

1.2.5乳析指數(shù)的測(cè)定 乳析指數(shù)是一個(gè)直觀(guān)反映乳液穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)乳化能力的參數(shù)。根據(jù)Surh等[19]的方法略有改動(dòng)測(cè)定TPI 乳液的乳析指數(shù)。將乳液密封于50 mL 玻璃瓶中（內(nèi)徑2.5 cm，高度6.0 cm），4 ℃保存。測(cè)定乳液儲(chǔ)存28 d 的乳析情況和實(shí)物圖拍照。記錄乳液析出清液層的高度（Hs）和乳液總高度（Ht），乳析指數(shù)（CI）計(jì)算公式如下：

1.2.6微觀(guān)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 參考Liu 等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。分別取不同熱處理的TPI 乳液30 μL 于離心管中，同時(shí)加入10 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的尼羅紅染液（甲醇溶解）和10 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%尼羅藍(lán)染液（蒸餾水溶解），在暗處反應(yīng)15 min 后取10 μL 混合液于載玻片上，蓋上蓋玻片，利用激光掃描共聚焦顯微鏡在100 × 油鏡下觀(guān)察，拍照分辨率為1 024× 1 024。尼羅藍(lán)染料對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色（在激發(fā)波長(zhǎng)為633 nm 和檢測(cè)波長(zhǎng)618～ 710 nm 發(fā)射波長(zhǎng)的激光下）觀(guān)察，尼羅紅染料對(duì)油滴進(jìn)行染色（在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 和檢測(cè)波長(zhǎng)580～ 620 nm 下）觀(guān)察。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)使用Origin 9.0 軟件作圖，數(shù)據(jù)間的顯著性差異采用 SPSS Statistics 24.0 軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），并且通過(guò)Duncan 法檢驗(yàn)平均值間的顯著性，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱處理對(duì)TPI 乳液電位和黏度的影響

由表1 可知，未經(jīng)熱處理的TPI 乳液表面電位值為（-18.55±1.26）mV，經(jīng)熱處理后，TPI 乳液帶負(fù)電荷不變且電位的絕對(duì)值均顯著增加（P＜0.05）。隨著加熱溫度的升高，乳液表面電荷絕對(duì)值呈先增加后減少的趨勢(shì)，經(jīng)70 ℃熱處理的TPI 乳液電位絕對(duì)值最大。這可能是因?yàn)槿橐航?jīng)熱處理后油-水界面的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，分子內(nèi)部帶電基團(tuán)和氨基酸殘基暴露[16]，界面蛋白質(zhì)的表面凈電荷增加。乳液界面蛋白電荷量的增加，液滴之間的靜電斥力增加[21]，從而防止液滴聚集，形成更穩(wěn)定的乳液體系。ZHAO 等[22]發(fā)現(xiàn)，谷蛋白經(jīng)100 ℃加熱60 min 后，蛋白質(zhì)表面凈電荷增大，蛋白聚集體柔性增加，與本研究結(jié)果一致。Zeta 電位是表征蛋白質(zhì)表面電荷量，與油滴間的靜電排斥力和相互吸引力有關(guān)，可作為乳液體系潛在穩(wěn)定性的指標(biāo)[23]。乳液的穩(wěn)定性與水油界面處蛋白膜的柔性有關(guān)，疏水性和帶電性氨基酸的暴露提高蛋白質(zhì)分子的柔性，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[24]。

表1 熱處理對(duì)TPI 乳液黏度的影響Table 1 Effect of heat treatment on viscosity of TPI emulsion

加熱處理后TPI 乳液黏度顯著增強(qiáng)（P＜ 0.05），其中70 ℃熱處理的乳液表面凈電荷最高，對(duì)應(yīng)的黏度最大。表1 表明黏度和zeta 電位在某種程度上具有一定的相關(guān)性，通過(guò)皮爾遜相關(guān)性的分析，黏度和電位的相關(guān)性系數(shù)值為0.666，較高的靜電排斥力對(duì)液體流動(dòng)的阻力更大[20]。乳液油水界面黏度與液滴發(fā)生絮凝時(shí)間相關(guān)，界面黏度越大，界面強(qiáng)度越大[25]，形成的乳液也越穩(wěn)定。熱處理導(dǎo)致TPI中肌球蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，尾部絲狀交聯(lián)形成小聚集體[2]，界面蛋白緊密結(jié)合，在油滴表面形成蛋白膜，油水界面處蛋白質(zhì)的相互作用增加乳液的黏度[26]。其次熱處理會(huì)使界面蛋白分子部分疏水性基團(tuán)暴露[27]，油滴與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用強(qiáng)，界面處的蛋白質(zhì)分子之間或蛋白質(zhì)與油滴之間的疏水相互作用結(jié)合穩(wěn)定，在剪切力的作用下仍然具有很高的黏度。

2.2 熱處理對(duì)TPI 乳液粒徑的影響

對(duì)TPI 乳液熱處理后其乳液粒徑的變化如圖1所示。未經(jīng)熱處理的TPI 乳液的初始粒徑為（643.36±38.53）nm，60～ 80 ℃熱處理后TPI 乳液的初始粒徑顯著性減?。≒＜ 0.05），其中70 ℃熱處理30 min 后的TPI 乳液的粒徑最小（507.21±7.98）nm。這可能是因?yàn)橐环矫婕訜徇^(guò)程中，疏松的乳液聚集體被分散為更小的液滴，加上液滴表面凈電荷增加，液滴在靜電斥力的作用下不易聚集[28]；另一方面熱處理使蛋白質(zhì)發(fā)生亞基的解離和分子的伸展，將原來(lái)被掩蓋的一些非極性基團(tuán)暴露在界面，疏水性增加，界面張力減小，蛋白質(zhì)與油滴結(jié)合作用增強(qiáng)，乳液液滴粒徑減小，穩(wěn)定性增強(qiáng)[17]。乳液液滴大小影響乳液的絮凝和聚集，液滴越小，聚集和絮凝越慢，乳液分層所需時(shí)間越長(zhǎng)[29]。而90 ℃處理后乳液粒徑減小不明顯（P＞ 0.05），可能是因?yàn)楫?dāng)溫度達(dá)90 ℃后，氨基酸殘基與其他分子通過(guò)氫鍵和二硫鍵作用形成聚集體[30]。4 ℃條件下，未經(jīng)熱處理的TPI 乳液貯藏7 d 粒徑迅速增大（P＜ 0.05），之后粒徑變化不明顯，這是因?yàn)閷?duì)照組乳液初始粒徑較大，液滴在重力作用和布朗運(yùn)動(dòng)作用下聚集速度快[14]。熱處理后的乳液在儲(chǔ)藏過(guò)程中粒徑緩慢增加，70 ℃加熱的TPI 乳液粒徑變化最小，可能是乳液加熱后黏度增加，以致液滴的空間位阻增大，降低了碰撞頻率。其中70 ℃熱處理的TPI 乳液黏度最大，液滴聚集速度慢，說(shuō)明乳液穩(wěn)定性最好。

圖1 熱處理對(duì)TPI 乳液粒徑的影響Fig.1 Effect of heat treatment on the particle size of TPI emulsion

2.3 熱處理對(duì)TPI 乳液乳析指數(shù)的影響

圖2 和圖3 分別是熱處理后TPI 乳液4 ℃靜置28 d 的乳析指數(shù)和直觀(guān)圖。由圖可知，未經(jīng)熱處理的TPI 乳液貯藏至5 d 出現(xiàn)乳液析出現(xiàn)象，7 d 底部明顯析出水層，28 d 乳液乳析指數(shù)達(dá)（16.11±1.28）%，說(shuō)明乳液不穩(wěn)定。乳液中油滴和水相發(fā)生相分離的快慢與液滴大小和液滴發(fā)生聚集的速度有關(guān)[32]。較大顆粒的液滴比較小的液滴移動(dòng)更快，發(fā)生聚集的現(xiàn)象就越明顯，因此對(duì)照組的乳液粒徑大，液滴易聚集，從而出現(xiàn)分層現(xiàn)象。乳液分層是由兩相密度差異引起的，較大的油滴向上移動(dòng)以致乳液底部析出水層，乳析指數(shù)高代表乳液穩(wěn)定性差[31]。60～ 90 ℃熱處理的TPI 乳液儲(chǔ)存28 d 仍保持穩(wěn)定，無(wú)分層現(xiàn)象?？赡苁且?yàn)槿橐杭訜岷箴ざ仍黾?，以致液滴的空間位阻增大，降低了碰撞頻率。其中70 ℃熱處理的TPI 乳液黏度最大，液滴聚集慢，另一方面也可能是因?yàn)橐旱伪砻鎺N電荷數(shù)量增加，液滴之間的靜電斥力增加，減少相互聚集。此結(jié)果再一次證明，熱處理能夠改善TPI 乳液的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)乳液的貯藏期。

圖2 熱處理對(duì)TPI 乳液乳析指數(shù)的影響Fig.2 Effect of heat treatment on creaming index of TPI emulsion

圖3 TPI 乳液貯藏過(guò)程直觀(guān)顯示Fig.3 Visual appearance of TPI emulsion during storage

2.4 熱處理對(duì)乳液微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響

熱處理對(duì)乳液微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響如圖4 所示。TPI乳液的蛋白質(zhì)經(jīng)尼羅藍(lán)染料染色后呈綠色，油滴經(jīng)尼羅紅染料染色后呈紅色。乳液液滴基本是呈現(xiàn)球狀，且蛋白質(zhì)成功包裹在油滴外部。未經(jīng)熱處理的TPI 乳液液滴聚結(jié)，顆粒較大且不規(guī)則。乳液的絮凝和聚集速率與油滴的分布情況和大小有關(guān)，可通過(guò)光共聚焦對(duì)其微觀(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察[2]。60 ℃和70 ℃熱處理30 min 后明顯看出TPI 液滴粒徑減小且分布均勻，而80 ℃和90 ℃熱處理后乳液部分液滴又發(fā)生聚結(jié)和絮凝。這個(gè)結(jié)果與粒徑隨著熱處理溫度的增加，乳液粒徑先減小后增大的結(jié)果一致，說(shuō)明一定程度的熱處理可能導(dǎo)致乳液油-水界面的張力下降，促進(jìn)更小的液滴產(chǎn)生，液滴的表面增加，乳液黏度增大。同時(shí)，乳液表面凈電荷增加，液滴之間凈電斥力增大，液滴不易聚集。而當(dāng)加熱溫度過(guò)高時(shí)，乳液失去抗聚結(jié)的能力，蛋白結(jié)構(gòu)過(guò)度展開(kāi)而聚結(jié)成大顆粒[33]。熱處理溫度過(guò)高導(dǎo)致乳液液滴之間相互作用形成的聚集體比未經(jīng)熱處理的乳液聚集體更加穩(wěn)定，因此80 ℃和90 ℃熱處理的乳液貯藏過(guò)程未發(fā)生分層。綜上，熱處理能夠改善TPI 乳液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

圖4 熱處理對(duì)TPI 乳液微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of heat treatment on microstructure of TPI emulsion

3 結(jié)論

熱處理（60、70、80、90 ℃加熱30 min）過(guò)程中界面蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，內(nèi)部基團(tuán)暴露，分子之間相互作用增強(qiáng)，乳液的表面凈電荷和黏度顯著增大（P＜ 0.05），延緩液滴的絮凝和聚結(jié)以及延長(zhǎng)乳液貯藏時(shí)間。其中，TPI 乳液經(jīng)70 ℃加熱30 min 效果最佳，乳液粒徑最小為（507.21±7.98）nm，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察乳液液滴較小且分布均勻，乳液穩(wěn)定性好且貯藏28 d 未分層。熱處理能夠有效改善TPI 乳液的穩(wěn)定性，控制溫度可改變?nèi)橐旱牧胶宛ざ取?/p>