和美霞，陳 波，胡 麗，張曉慶，季秀玲，魏云林，張 琦

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

類胡蘿卜素（carotenoid）是一類重要脂溶性色素的總稱，是由異戊二烯骨架構(gòu)成的C40 或C30萜類化合物，其廣泛存在于植物、細(xì)菌、真菌和藻類中. 類胡蘿卜素是人體內(nèi)維生素A 的前體，但人和動(dòng)物不能自身合成，攝入類胡蘿卜素可提高人體免疫力[1]. 此外，類胡蘿卜素還具有著色、抗氧化、抗凋亡和抗癌作用[2-5]. 類胡蘿卜素是以乙酰CoA作為底物，經(jīng)甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑合成焦磷酸異戊烯基（isopentenylpyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），二者經(jīng)濃縮并經(jīng)不同反應(yīng)過程進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為番茄紅素、β-胡蘿卜素等不同類胡蘿卜素[6]. 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）生成MVA，是MVA 合成途徑中的限速酶，也是異戊二烯生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，對于類胡蘿卜素和麥角固醇等異戊二烯衍生物的生物合成有著重要作用[7-8].

HMGCR 廣泛存在真核生物、原核生物和古細(xì)菌中，是一種高度保守的膜結(jié)合酶[9]. 根據(jù)氨基酸序列的差異，HMGCR 可以分為Ⅰ類和Ⅱ類，真核生物和古菌的HMGCR 屬于Ⅰ類，其利用NADPH作為電子供體，而細(xì)菌的HMGCR 屬于Ⅱ類并利用NADH 作為電子供體[10-12]. 真核生物HMGCRs在氨基酸序列上存在很大差異，但一些關(guān)鍵位點(diǎn)如底物結(jié)合位點(diǎn)TTEGALVA 和ENVIGX3I/LP，NADPH 結(jié) 合 位 點(diǎn)DAMGMNMIS 和GTVGGGT，以及與催化活性相關(guān)的4 個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基Glu、Lys、Asp 和His 卻高度保守[13-14]. 研究還表明，Ⅰ類HMGCR 的N 末端具有參與甾醇感應(yīng)、蛋白泛素化降解調(diào)節(jié)和催化反應(yīng)的多種跨膜結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域在每種物種中種類和個(gè)數(shù)不同，而且序列變化很大[9,13-14].

目前，商業(yè)化的類胡蘿卜素來源主要是通過化學(xué)合成獲得，少量是從植物提取和微生物發(fā)酵生產(chǎn)的天然類胡蘿卜素. 化學(xué)合成的類胡蘿卜素雖然具有天然類胡蘿卜素類似的分子結(jié)構(gòu)，但天然類胡蘿卜素更有利于健康，因此人們對其需求也日益增加[1].近年來通過代謝工程研究使微生物高效益、低成本生產(chǎn)類胡蘿卜素逐漸成為有希望的替代途徑[15]，而且產(chǎn)油紅酵母由于保持產(chǎn)油酵母發(fā)酵上的優(yōu)勢并能持續(xù)提供乙酰CoA 合成類胡蘿卜素和油脂等各種衍生物的優(yōu)點(diǎn)逐漸成為研究熱點(diǎn)[16]. 紅冬孢酵 母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235 是一株分離自云南程海的產(chǎn)油紅酵母菌株[17]，和很多紅酵母一樣，YM25235 菌株也主要合成圓酵母素（torulene）、紅酵母紅素（torularhodin）、γ-胡蘿卜素（γ-carotene）、β-胡蘿卜素（β-carotene）等4 種類胡蘿卜素[18-19]. 因此，本研究擬從YM25235 菌株中克隆HMGCR基因RkHMGCR，并將其轉(zhuǎn)回YM25235菌株中進(jìn)行過表達(dá)，以提高YM25235 菌株產(chǎn)類胡蘿卜素的水平，為進(jìn)一步篩選類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株和工藝化生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究與應(yīng)用打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 質(zhì) 粒 和 菌 株紅 冬 孢 酵 母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235 菌株由云南大學(xué)微生物研究所李紹蘭研究員惠贈，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 由本研究室保存，質(zhì)粒pMD-18T 購自寶生物工程（大連）有限公司，表達(dá)載體pRH2034 購自新加坡民族大學(xué).

1.2 試劑和試劑盒DNA 純化回收試劑盒購自北京百泰克生物有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega 公司，酵母基因組DNA 和RNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司，限制性內(nèi)切酶購自Thermo 公司，高保真DNA 聚合酶購自南京諾維贊生物有限公司，高效液相所用試劑為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.3 RkHMGCR 基因的克隆與序列分析根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的RkHMGCR基因的蛋白質(zhì)編碼序列設(shè)計(jì)并合成引物對：上游引物RkHMGCR-F：5′-TTCGGATCCTTATGGTCCTCTCGCCGTC-3′和下游引物RkHMGCR-R：5′-GCAGATATCTTACT CTTTGGCGAACCCG-3′（下劃線分別為BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ位點(diǎn)），以提取自YM25235 菌株的總RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增. 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸4 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min. 擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與pMD-18T 載體連接，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR驗(yàn)證后，挑取陽性克隆送出測序. 進(jìn)一步根據(jù)測序所得的目的序列，利用NCBI 網(wǎng)站的BLASTp 程序進(jìn)行同源序列比對，同時(shí)參考已報(bào)道的HMGCR 序列分析結(jié)果，利用NCBI 上Conserved Domain 程序進(jìn)行蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)域預(yù)測.

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pRHRkHMGCR 的構(gòu) 建用BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ對連接有基因RkHMGCR的pMD-18T 載體和表達(dá)載體pRH2034 進(jìn)行雙酶切，電泳回收目的片段后用T4 連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 中. 通過菌落PCR 和提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定來篩選陽性克隆，然后進(jìn)一步將重組質(zhì)粒送出進(jìn)行測序驗(yàn)證，所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pRHRkHMGCR.

1.5 重 組 質(zhì) 粒pRHRkHMGCR 的 轉(zhuǎn) 化 與 篩 選將重組質(zhì)粒pRHRkHMGCR 通過電擊轉(zhuǎn)化法[20]轉(zhuǎn)入YM25235 中，通過含150 μg/mL 潮霉素B 的YPD固體培養(yǎng)基篩選得到抗性轉(zhuǎn)化子. 利用酵母基因組提取試劑盒提取抗性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，以此為模板通過PCR 進(jìn)行陽性克隆驗(yàn)證獲得HMGCR基因轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子. 將PCR 驗(yàn)證正確的陽性克隆于50 mL YPD 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至192 h，離心收集菌體，冷凍干燥后磨成粉. 取0.4 g 干菌體使用丙酮進(jìn)行多次提取后，合并提取液. 然后參考文獻(xiàn)[21]的方法，利用紫外分光光度計(jì)在450 nm 處測定吸光度并計(jì)算總類胡蘿卜素含量. 經(jīng)多次篩選后得到高產(chǎn)類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化子，命名為YM25235/pRHRkHMGCR.

1.6 總類胡蘿卜素及其組分質(zhì)量比變化分析以YM25235 菌株為對照，按上述方法分別提取YM25235 菌株和轉(zhuǎn)基因菌株YM25235/pRHRkHMGCR 的總類胡蘿卜素，分析YM25235/pRHRkHMGCR 菌株中總類胡蘿卜素的質(zhì)量比變化情況.進(jìn)一步通過高效液相色譜法（HPLC）對總類胡蘿卜素的4 種主要成分的質(zhì)量比變化進(jìn)行檢測分析，HPLC 分析條件參照魏娜等[22]的方法，液相色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（?4.6 mm×250 mm，5 μm）.

1.8 脂肪酸含量的測定分析參考文獻(xiàn)[23]檢測YM25235 和YM25235/pRHRkHMGCR 菌株中脂肪酸的含量變化. 稱取上述干菌粉0.1 g，加入2.5 mL 10% KOH 甲醇溶液和2.5 mL 0.6 mg/mL C17 內(nèi)標(biāo)物提取脂肪酸，并與70 ℃下皂化4.5 h. 然后用濃鹽酸將樣品的pH 調(diào)至2.0，加入4 mL 14%三氟化硼乙醚，繼續(xù)在70 ℃水浴1.5 h，使脂肪酸甲酯化.最后用正己烷萃取脂肪酸甲酯，并用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）進(jìn)行分析.

1.9 類胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析取發(fā)酵培養(yǎng)96 h 的酵母細(xì)胞，提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以YM25235 菌株樣品作為對照，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測RkHMGCR基因過表達(dá)對類胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化. 以小亞基rRNA（SSU rRNA）基因作為內(nèi)參，通過 2-△△CT法[24]分析不同基因的相對轉(zhuǎn)錄水平. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析所用引物如表1 所示.

表1 YM25235 菌株中不同基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分析所用的引物Tab. 1 Primers used for the analysis of mRNA levels in YM25235 strain

2 結(jié)果與分析

2.1 RkHMGCR 基 因 的 克 隆以 紅 冬 孢 酵 母YM25235 的 cDNA 為模板，通過PCR 擴(kuò)增，獲得一個(gè)大小約為4 000 bp 的片段（圖1），將其命名為RkHMGCR. 回收獲得該片段，進(jìn)一步將其連接到PMD-18T 載體上并送出測序. 測序結(jié)果顯示RkHMGCR基因片段長為3 981 bp，編碼1 326 個(gè)氨基酸，預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（Mr）為145.68 ku.

圖1 RkHMGCR 基因的PCR 擴(kuò)增Fig. 1 PCR Amplification of the gene RkHMGCR

2.2 序列的分析相似性搜索表明，RkHMGCR編碼的氨基酸序列（GenBank 登錄號：MW448479）與酵母來源的HMGCR 的氨基酸序列相似性最大，其中與圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）NP11 來源 RtHMGCR（GenBank 登錄號：XP_01627-0872）、紅法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）XdHMGCR 酶（GenBank 登錄號：CED85502）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C 的ScHMGCR 酶（GeneBank 登錄號：NP_013636）的相似性分別為81.94%、35.63%和23.61%. 序列比對分析結(jié)果還表明，所編碼的氨基酸序列和已知的HMGCR 酶類似，具有特異性的4 個(gè)氨基酸保守區(qū)[14,25]：2 個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)TTEGALVA（氨基酸位點(diǎn)為970～977）和ENVVGYMPLP（氨基酸位點(diǎn)為941～950），2 個(gè)NADP（H）結(jié)合位點(diǎn)DAMGMNMIS（氨基酸位點(diǎn)為1 065～1 073）和GTVGGGT（氨基酸位點(diǎn)1 214～1 220），以及4 個(gè)催化活性中心關(guān)鍵的氨基酸殘基 Glu、Lys、Asp、His（其氨基酸位點(diǎn)分別為 972、1 105、1 181、1 279）（圖2）. 此外，氨基酸序列比對分析也顯示，除了具有4 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和關(guān)鍵氨基酸殘基的氨基酸序列保守性高外，其余氨基酸序列在不同來源HMGCS 中變化較大（N 端序列長，結(jié)果未提供），與已報(bào)道分析結(jié)果[13-14]一致. 這些結(jié)果表明所獲得的cDNA 序列是一個(gè)新的潛在HMGCR基因編碼序列.

圖2 RkHMGCR 與同源RkHMGCRs 氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of amino acid sequence of RkHMGCR and homologous HMGCRs

2.3 重組質(zhì)粒pRHRkHMGCR 的構(gòu)建首 先通過雙酶切連接將RkHMGCR從PMD18-T 切下并插入到表達(dá)載體pRH2034 的BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ 位點(diǎn)之間構(gòu)建重組質(zhì)粒pRHRkHMGCR（圖3(a)）. 然后對其重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證分析，結(jié)果如圖3(b)所示，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pRHRkHMGCR酶切產(chǎn)生4 kb 和10.7 kb 兩條帶（圖 3(b) 第 4 泳道），這兩個(gè)條帶分別與目的基因RkHMGCR擴(kuò)增片段（圖 3(b) 第 5 泳道）和空載體 pRH2034 雙酶切后（圖3(b) 第 3 泳道）的大小一致. 同時(shí)，測序結(jié)果也表明所獲得片段與目的序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pRHRkHMGCR 的構(gòu)建Fig. 3 Construction of recombination plasmid pRHRkHMGCR

2.4 過表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株總類胡蘿卜素和各組分含量的影響總類胡蘿卜素含量分析結(jié)果表明，過表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR 中的總類胡蘿卜素質(zhì)量比為8.12 mg/g，相較于對照菌株YM25235（5.71 mg/g）提高了42.21%（表2）. 進(jìn)一步通過HPLC 分析總類胡蘿卜素中4種不同組分含量變化，結(jié)果顯示，過表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR 中圓酵母素、紅酵母紅素、β-胡蘿卜素的均顯著提高，但γ-胡蘿卜素含量反而下降. 其中β-胡蘿卜素含量提高最為顯著，達(dá)4.58 mg/g DCW，占總類胡蘿卜素含量的56.40%，相較于對照（48.86%）β-胡蘿卜素含量在總類胡蘿卜素含量中明顯提高. 這些結(jié)果表明，過表達(dá)RkHMGCR基因能顯著提高YM25235 菌株中總類胡蘿卜素及β-胡蘿卜素含量.

表2 過表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株中類總胡蘿卜素質(zhì)量比及其組分質(zhì)量比的影響Tab. 2 Effect of RkHMGCR overexpression on the content of total carotenoid and its compositions in YM25235

2.5 過表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株油脂積累的影響類胡蘿卜素合成與油脂合成都是以乙酰CoA 作為共同前體. 在本研究中，過表達(dá)RkHMGCR基因提高了YM25235 中類胡蘿卜素的質(zhì)量比，在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步測定對照菌株YM25235 和過表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR的油脂質(zhì)量比. 結(jié)果如表3 所示，過表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR 中油脂質(zhì)量比約為3.44%，較對照菌株YM25235（4.84% DCW）降低了28.93%.表明過表達(dá)RkHMGCR基因會減少YM25235 中油脂的積累.

表3 RkHMGCR 基因過表達(dá)對YM25235 菌株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Tab. 3 Effect of RkHMGCR overexpression on the lipid content in YM25235

2.6 過表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響為探究過表達(dá)RkHMGCR基因?qū)M25235 中脂肪酸含量的影響，我們提取對照菌株YM25235 和過表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR 的總脂肪酸并進(jìn)行GC-MS 分析. 結(jié)果如表4 所示，過表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR中總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降約20.31%，其中棕櫚酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）和亞油酸（oleic acid，OA，C18∶1）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降，而多不飽和脂肪酸亞油酸（linoleic acid，LA，C18∶2）和α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA，C18∶3）的含量卻有所增加.該結(jié)果表明，RkHMGCR基因過表達(dá)促進(jìn)YM25235中脂肪酸的降解，可能提供了更多的乙酰CoA 進(jìn)入類胡蘿卜素合成途徑，促進(jìn)類胡蘿卜素合成，同時(shí)上述油脂累積的降低也證明了這一觀點(diǎn).

表4 RkHMGCR 基因過表達(dá)對YM25235 菌株脂肪酸組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Tab. 4 Effect of RkHMGCR overexpression on the content of fatty acid compositions in YM25235

2.7 過表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株類胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響為進(jìn)一步探究過表達(dá)RkHMGCR基因促進(jìn)YM25235 類胡蘿卜素合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，我們分析了類胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化. 結(jié)果如圖4 所示，過表達(dá)RkHMGCR基因能促進(jìn)MVA 途徑中基因RkAcat2、RkHMGCS、自身RkHMGCR轉(zhuǎn)錄水平的明顯提高，分別為對照的1.76、1.58 和4.14 倍，而類胡蘿卜素合成途徑中基因RkCrtYB、RkCrtI的轉(zhuǎn)錄水平略有提高，但不顯著. 此外，與油脂合成相關(guān)基因RkFAS1和RkACCS轉(zhuǎn)錄水平分別下降了59.31%和40.23%，而與脂肪酸β-氧化相關(guān)基因RkACOX2轉(zhuǎn)錄水平則也有顯著提高，達(dá)2.18 倍. 這些結(jié)果與類胡蘿卜素的合成水平和油脂含量的積累趨勢一致，只是不同基因轉(zhuǎn)錄水平的變化有所差異.

圖4 RkHMGCR 基因過表達(dá)對YM25235 菌株中類胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 4 Effect of RkHMGCR overexpression on the transcription levels of genes involved with carotenoid biosynthesis and lipid metabolism

3 討論

HMGCR 廣泛存在真核生物、原核生物和古細(xì)菌中，是一種高度保守的膜結(jié)合酶[9]. 氨基酸序列相似性搜索結(jié)果顯示，紅冬孢酵母RkHMGCR 與酵母來源的HMGCR 具有最大的同源性. 氨基酸序列分析結(jié)果也顯示，紅冬孢酵母RkHMGCR 同樣具有HMGCR 保守的2 個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)ENVVGYMPLP 和TTEGALVA、2 個(gè)NADP（H）結(jié)合位點(diǎn)DAMGMNMIS 和GTVGGGT，以及4 個(gè)催化活性中心關(guān)鍵的氨基酸殘基 Glu、Lys、Asp、His，而且序列比對分析結(jié)果還顯示，所分析的4 種HMGCR的C 端氨基酸序列同源性雖然高于N 端，但是總體同源性均很低，這些均與之前的研究結(jié)果一致[13-14]. 這些結(jié)果表明，我們獲得的RkHMGCR基因是一個(gè)新的潛在的HMGCR基因.

由于HMGCR 在MVA 途徑以及包括類胡蘿卜素等異戊二烯衍生物合成中的重要調(diào)節(jié)作用，可以推測出提高HMGCR 的表達(dá)水平可顯著提高類胡蘿卜素等異戊二烯衍生物的合成水平. 這在許多通過代謝工程手段將HMGCR基因過表達(dá)提高宿主細(xì)胞中類胡蘿卜素的合成的研究中獲得證實(shí)，比如，Yan 等[8]通過產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組釀酒酵母工程菌株中過表達(dá)HMGCR基因，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了35.1%，如果同時(shí)抑制麥角固醇合成則提高了106.8%. 還有一些研究將截短的外源HMGCR基因在不同重組酵母宿主中過表達(dá)，都能顯著提高目的類胡蘿卜素的產(chǎn)量[26-28]. 本研究將RkHMGCR基因轉(zhuǎn)化回YM25235 菌株中進(jìn)行過表達(dá)分析，與上述報(bào)道類似，RkHMGCR基因過表達(dá)顯著提高了YM25235 菌株中類胡蘿卜素的合成水平，相較于對照提高了42.21%，其合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析也證明了這一點(diǎn). 相較于類似的研究[27-28]，RkHMGCR基因過表達(dá)的YM25235 菌株類胡蘿卜素產(chǎn)量的增加不是最高，這可能是培養(yǎng)條件和表達(dá)系統(tǒng)存在差異的原因，并且細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸供應(yīng)的瓶頸不僅僅是HMGCR 催化的反應(yīng)，還涉及AcaT和HMGCS 的催化作用[29]. 然而，本研究結(jié)果證明了提高M(jìn)VA 途徑限速酶HMGCR 的表達(dá)水平可顯著提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量.

紅法夫酵母類胡蘿卜素合成調(diào)節(jié)機(jī)制的研究表明，葡萄糖不足或饑餓條件下菌株中類胡蘿卜素合成與氧化脅迫有關(guān)，還涉及脂代謝和糖代謝等生物學(xué)過程[30-31]. 乙酰CoA 是油脂（脂肪酸）和類胡蘿卜素合成的共同前體，有研究表明，粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）在葡萄糖不足或饑餓條件下通過選擇性降解棕櫚酸和油酸，產(chǎn)生乙酰CoA 促進(jìn)類胡蘿卜素的合成，導(dǎo)致油脂累積減少[32-33]. 我們前期的研究也顯示，葡萄糖饑餓條件下YM-25235 菌株中油脂累積水平明顯下降（結(jié)果未發(fā)表），而過表達(dá)RkHMGCR基因脂肪酸含量也明顯下降（表3 和表4），導(dǎo)致油脂累積下降更加明顯與脂肪酸降解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加也證明這一點(diǎn). 而且，RkHMGCR基因過表達(dá)的YM25235菌株中類胡蘿卜素合成增加的底物乙酰CoA 可能主要來自棕櫚酸和硬脂酸的降解，而油酸含量下降可能是由于其進(jìn)一步脫飽和形成亞油酸和α-亞麻酸所致，多不飽和脂肪增加的具體原因還有待于進(jìn)一步研究.

由于類胡蘿卜素良好的生物活性和生理功能，近年來被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、營養(yǎng)保健等行業(yè)，促進(jìn)了人類對其需求. 目前，商業(yè)化的類胡蘿卜素來源主要通過化學(xué)合成獲得，少量從植物提取和微生物發(fā)酵生產(chǎn)的天然類胡蘿卜素，雖然具有類似的分子結(jié)構(gòu)，但天然類胡蘿卜素更有利于健康[1]. 通過傳統(tǒng)微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)類胡蘿卜素顯示出巨大潛力，成本低、生產(chǎn)過程易于處理、產(chǎn)品安全而且環(huán)保[34]. 但是，目前由于成本效益、產(chǎn)量和分離提取等方面的限制，工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)方面仍缺乏相應(yīng)的策略[35]. 近年來，結(jié)合經(jīng)典遺傳學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法以及發(fā)酵工藝技術(shù)，優(yōu)化菌株原有的代謝途徑和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)或者組裝異源代謝途徑使微生物高效益、低成本生產(chǎn)類胡蘿卜素的代謝工程提供了一種有希望的替代途徑[15]. 因此，本研究為進(jìn)一步篩選類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株和工藝化生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究與應(yīng)用打下基礎(chǔ)，也為利用產(chǎn)油紅酵母進(jìn)行相關(guān)的代謝工程研究提供參考. 目前，這方面的研究鮮有報(bào)道.