辣椒細菌性果實條斑病菌生物學(xué)特性及抑菌藥劑篩選

張盧慧，趙志強，趙全新，郭慶元

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052）

0 引言

辣椒(Capsicum annuum)是全球第一大蔬菜，是世界上種植面積最大的蔬菜作物之一[1-2]。在世界辣椒種植的范圍內(nèi)，中國在辣椒的生產(chǎn)與出口上均占據(jù)首位[3-4]。由于辣椒對外界環(huán)境的適應(yīng)性強、品種多、種植面積大且收益多，所以辣椒的種植不僅幫助農(nóng)民增收致富，同時也成為了農(nóng)村發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)，促進了農(nóng)村經(jīng)濟的發(fā)展[5]。隨著辣椒種植面積的擴大，發(fā)生在辣椒上的病害逐漸增加，嚴重制約著辣椒的品質(zhì)及產(chǎn)量。文獻已報道的辣椒病害主要有辣椒病毒病[6]、辣椒真菌性病害[7-8]以及辣椒細菌性病害[9-10]，其中辣椒細菌性病害主要有細菌性瘡痂病、細菌性葉斑病、軟腐病、潰瘍病、青枯病[11-15]，這些病害對辣椒的生產(chǎn)造成了很大的影響。針對以上報道的辣椒病害，國內(nèi)外研究人員對其病原鑒定、發(fā)病規(guī)律、防治方法等均進行了深入的研究[16-18]，為辣椒病害的防治起到了很好的作用。

新疆作為國內(nèi)辣椒產(chǎn)業(yè)的一支新軍，近年來發(fā)展速度非?？靃19]，2018年，筆者在新疆巴州和碩縣辣椒種植區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種新的辣椒細菌性果實條斑病病害，該病害主要侵染辣椒果實、葉柄及嫩莖，以果實病斑最為顯著，葉片無明顯癥狀，發(fā)病的辣椒果實表面布有褐色的條形病斑，據(jù)調(diào)查，該病害在當(dāng)?shù)乩苯飞a(chǎn)中發(fā)生普遍，是危害最大的病害，該病害的發(fā)病癥狀與國內(nèi)外已報道的辣椒細菌性病害及辣椒條斑病毒病不同，是一種國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)病害。在前期的工作中，筆者對該病害的病原菌進行了鑒定，病原菌鑒定為阿根廷假單胞菌(P.argentinensis)，而關(guān)于該病害的發(fā)病規(guī)律及防治等未開展相關(guān)的研究，因此筆者針對病原菌的生物學(xué)特性及藥劑篩選開展研究，以期為田間病害規(guī)律研究和病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 從新疆巴州和碩縣辣椒種植區(qū)采集的辣椒細菌性條斑病病樣，對病樣采用組織分離、煙草過敏性反應(yīng)、致病性回接測定、形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測定、16S rDNA分子鑒定，嚴格鑒定并保存好的致病菌株阿根廷假單胞菌菌株KHL-1。

1.1.2 供試藥劑 查閱文獻上報道的細菌殺菌劑[20-22]，同時結(jié)合市場上的細菌性殺菌劑，選擇18種供試細菌殺菌劑（表1）。

表1 18種供試殺菌劑藥劑類型

1.2 辣椒細菌性條斑病病原菌生物學(xué)特性測定

1.2.1 病原菌的活化與接種液的制備 將病原菌平板劃線于NA固體培養(yǎng)基平板上，28℃活化培養(yǎng)48 h后，挑取培養(yǎng)基表面長出的單菌落轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)液中，28℃、160 r/min過夜振蕩培養(yǎng)12 h，用紫外分光計測定菌液的OD600值，至OD600值為1.0～1.2左右時作為接種液用。

1.2.2 溫度對病原菌生長的影響 將制備好的NA培養(yǎng)液分裝到試管中，每個試管中分裝10 mL NA培養(yǎng)液，按照1.2.1的方法制備接種液，每個分裝的試管中分別加入0.1 mL的接種液。將接種后的試管分別置于溫度為0、5、10、15、20、25、28、30、35、40℃的ZWY-2102C全溫型多振幅軌道搖床上，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，每組溫度設(shè)置3個重復(fù)，以不接菌培養(yǎng)液為對照，振蕩培養(yǎng)48 h后，在紫外分光光度計下測定并記錄菌液在不同溫度下的OD600值。

1.2.3 pH對病原菌生長的影響 用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液將NA培養(yǎng)液的pH分別調(diào)整為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。按照1.2.2的方法接種病原菌，每組處理設(shè)3個重復(fù)，以不接菌培養(yǎng)液為對照，將搖床設(shè)置成28℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h。在搖床振蕩培養(yǎng)48 h后，在紫外分光光度計下測定并記錄菌液在不同pH下的OD600值。

1.2.4 NaCl濃度對病原菌生長的影響 以不加NaCl的NA培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，將NA培養(yǎng)液中NaCl濃度分別配制成0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%。按照1.2.2的方法接種病原菌，每個NaCl濃度設(shè)3次重復(fù)，以不接菌培養(yǎng)液為對照，將搖床設(shè)置成28℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h。在搖床振蕩培養(yǎng)48 h后，在紫外分光光度計下測定并記錄菌液在不同NaCl濃度下的OD600值。

1.3 室內(nèi)藥劑毒力篩選試驗

采用濾紙片抑菌圈法進行測定[23]，參考王璐瑤等[24]報道的室內(nèi)藥劑毒力篩選試驗，試驗分為2步進行，（1）按照田間推薦使用濃度將18種供試藥劑按有效成分用無菌水配制成5個濃度進行初篩試驗，每個濃度3個重復(fù)，以無菌水為對照。先用移液槍吸取用無菌水稀釋至106的菌懸液100μL，用涂布棒均勻地涂布在NA平板上，涂完后將平板靜置，待涂有菌的培養(yǎng)基表面干燥。用鑷子夾取直徑6 mm滅過菌的濾紙片，放入配制好的藥液中吸附1 min，再用鑷子將浸泡過藥劑的濾紙片取出，由于取出的濾紙片上吸附的藥劑過多，將濾紙片放在三角瓶瓶口壁上使多余的藥劑滴落，再用鑷子夾取濾紙片等距離的放置在NA平板上，每皿放置3片濾紙片，將平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測量不同藥劑在不同濃度下病原菌的抑菌圈大小。（2）將初篩中有抑菌效果的藥劑進行室內(nèi)毒力測定試驗，以藥劑濃度的對數(shù)為自變量，抑菌圈的平均直徑為因變量，求出毒力回歸方程[25]，比較不同藥劑的EC50值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 26.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對病原菌生長的影響

由圖1可以得出，病原菌在培養(yǎng)的溫度5～40℃內(nèi)均能夠生長，病原菌的最適生長溫度為28℃。當(dāng)病原菌培養(yǎng)的溫度在5℃以下時，病原菌的生長受到抑制。

圖1 病原菌在不同溫度下的生長情況

2.2 酸堿度對病原菌生長的影響

由圖2可以得出，病原菌在培養(yǎng)液的pH 5.0～11.0時均能夠生長，培養(yǎng)液pH 7最適宜病原菌的生長。培養(yǎng)液pH 6時紫外分光光度計下測得的菌液OD600值為1.074，而當(dāng)培養(yǎng)液pH 8時紫外分光光度計下菌液OD600值0.797，說明菌體適宜在中性偏酸的環(huán)境中生長。當(dāng)培養(yǎng)液pH 5.0以下、pH 11.0以上時，病原菌的生長停滯，病原菌的生長受到抑制。

圖2 病原菌在不同pH下的生長情況

2.3 鹽濃度對病原菌生長的影響

由圖3可以得出，病原菌的耐鹽性范圍為0%～12%，在該范圍內(nèi)病原菌能夠生長。當(dāng)培養(yǎng)液中的NaCl濃度為2%時，能夠促進病原菌的生長。當(dāng)培養(yǎng)液中的NaCl濃度超過12%時，病原菌的生長停滯，病原菌的生長受到抑制。

圖3 耐鹽性測定

2.4 供試藥劑室內(nèi)抑菌測定結(jié)果

由表2可以看出，供試的18種細菌殺菌劑在制劑推薦使用濃度范圍內(nèi)，不同的藥劑對病原菌的抑制效果不同。18種供試藥劑中，四霉素、乙蒜素、氯溴異氰尿酸、77%志信在制劑推薦使用濃度范圍內(nèi)設(shè)置的5個濃度下對病原菌均有抑制作用。2%春雷霉素僅在藥劑濃度為50、100 mg/L對病原菌有抑制作用，20%乙酸銅僅在藥劑濃度為10000 mg/L時對病原菌有抑制作用，在其余的濃度下無抑菌效果。其余的12種供試藥劑在田間推薦使用濃度范圍內(nèi)設(shè)置的5個濃度對病原菌均無抑菌作用。

表2 18種殺菌劑在不同濃度下對辣椒細菌性果實條斑病菌抑制作用

由于只有四霉素、乙蒜素、氯溴異氰尿酸、77%志信這4種藥劑在田間推薦使用濃度范圍內(nèi)設(shè)置的5個濃度均對病原菌有抑制效果，因此以這4種藥劑供試的藥劑濃度的對數(shù)為自變量，抑菌圈平均直徑為因變量，得到毒力回歸方程及EC50。

4種供試藥劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果（表3）表明，四霉素、乙蒜素、77%志信、氯溴異氰尿酸4種藥劑的EC50值分別為11.75、340.95、994.36、1464.71 mg/L，其中以四霉素的毒力最強，高于其余3種藥劑。

表3 4種殺菌劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果

續(xù)表2

3 結(jié)論與討論

辣椒細菌性果實條斑病是發(fā)生在新疆巴州和碩縣辣椒種植區(qū)的一種新病害，其病原菌為阿根廷假單胞菌(Pseudomonas argentinensis)，由于該病害是一種新病害，國內(nèi)對于該病害的研究尚未有相關(guān)文獻的報道，為了給田間病害規(guī)律研究和病害防治提供理論依據(jù)基礎(chǔ)，本研究在前期病原菌準(zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)上，對病原菌開展生物學(xué)特性及藥劑篩選試驗。對病原菌的部分生物學(xué)特性進行測定，結(jié)果表明病原菌在外界環(huán)境溫度為5～40℃范圍內(nèi)均能生長，最適宜生長溫度范圍為25～35℃，6月為該病害高發(fā)期。病原菌在pH 5.0～11.0范圍內(nèi)均能生長，菌體適宜在中性偏酸的環(huán)境中生長，最適pH 7.0，當(dāng)pH 5.0以下、pH 11.0以上時，病原菌的生長停滯。病原菌在NaCl濃度為0%～12%范圍內(nèi)均可以生長，其中以2%的NaCl濃度促進病原菌的生長，病原菌的耐鹽性為12%。

續(xù)表3

在病原菌的室內(nèi)藥劑篩選試驗中，供試的18種細菌殺菌劑在田間推薦使用濃度下，四霉素、乙蒜素、氯溴異氰尿酸、77%志信在田間推薦使用濃度范圍內(nèi)設(shè)置的5個濃度下對病原菌均有抑制作用，2%春雷霉素在藥劑濃度為50、100 mg/L對病原菌有抑制作用，20%乙酸銅僅在藥劑濃度為10000 mg/L時對病原菌有抑制作用，其余的12種供試藥劑在田間推薦使用濃度范圍內(nèi)設(shè)置的5個濃度下對病原菌均無抑菌作用。毒力測定結(jié)果表明四霉素的毒力較強，EC50值為11.75 mg/L，毒力強于其他藥劑，可作為防治的首選。由于本試驗毒力測定結(jié)果僅是室內(nèi)平板篩選出的結(jié)果，不同的藥劑作用在植物上的機理不同，其對病害的防效也不同，因此在室內(nèi)篩選出的具有抑菌作用的藥劑，還需進一步試驗確定其防治效果及用于防治的最適濃度，為田間病害防治提供防治基礎(chǔ)。