李娜 趙紅霞

摘要：目的：檢測慢性應(yīng)激高血壓大鼠頭端延髓腹外側(cè)區(qū)組織中腺苷、cAPM含量的變化，探討慢性應(yīng)激下高血壓的病理機(jī)制。方法：將12只大鼠隨機(jī)分成Sham組、CS組，采取4周反復(fù)刺激構(gòu)建慢性應(yīng)激高血壓模型，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠RVLM區(qū)腺苷、cAPM的變化。結(jié)果：與Sham組相比，CS組血壓升高，腺苷、cAPM含量下調(diào)（P<0.01）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了慢性應(yīng)激高血壓大鼠模型，慢性應(yīng)激條件下腺苷、cAPM含量下調(diào)可能是高血壓發(fā)生與發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素。

關(guān)鍵詞：慢性應(yīng)激;高血壓;腺苷;cAPM;動(dòng)物模型

高血壓是引起心腦血管疾病的重要因素[1]，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們承受的慢性應(yīng)激也越來越大，這些壓力的持續(xù)存在給人們帶來了嚴(yán)重傷害[2]。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)慢性應(yīng)激高血壓大鼠頭端延髓腹外側(cè)區(qū)（Rostral Ventrolateral Medulla， RVLM）的腺苷、cAMP進(jìn)行測定，初步探討在慢性應(yīng)激所致高血壓發(fā)展過程中血管舒張因子的含量變化情況，揭示慢性應(yīng)激狀態(tài)下高血壓復(fù)雜的病理機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290 Infinity HpLC與6470 TQ MS/MS（安捷倫科技，美國），雙極銀絲記錄電極（北京旭月科技有限公司），示波器（美國Tektronix oscilloscoPe公司），腺苷、cAMP和醋酸銨均購自Sigma（St. Louis， Missouri， USA），氨水購自泰坦科技股份有限公司，乙腈（色譜純，默克公司），水為超純?nèi)ルx子水（18.2 M）。

1.2 動(dòng)物模型的建立

8周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠12只，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。動(dòng)物飼養(yǎng)嚴(yán)格按照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南進(jìn)行。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成Sham組、CS組，每組6只。慢性應(yīng)激高血壓大鼠模型參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]。Sham組除不給予應(yīng)激刺激外，其他條件與CS組相同。

1.3 血壓測定與樣本收集

血壓測定參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[4]。測量結(jié)束后，大鼠行安樂死。斷頭取出RVLM區(qū)組織，-80℃冰箱保存。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱HyPercarb Column（3 μm，2.1×100 mm，Thermo Fisher Scientific），柱溫35℃。流動(dòng)相15mM醋酸銨-0.3%氨水（A）-15mM醋酸銨-0.3%氨水-90%乙腈（B），Posttime 3 min。洗脫梯度：0～2 min，3%B;2～10 min，3%～50%B;10～14 min，50%～85%B，14～17 min，85%。流速0.35 ml/min，進(jìn)樣量1 μl。

1.4.2 質(zhì)譜條件

ESI+動(dòng)態(tài)MRM模式，Gas TemP 350℃，Gas Flow 10 L/min，Nebulizer 40 Psi，SheathGasHeater 350℃，SheathGasFlow 11 L/min，CaPillary 4 000 V，其他參數(shù)見表1，色譜圖見圖1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于容量瓶中，加入水，配制約1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1.6 樣品的前處理

精密稱取腦組織，加入200 μl甲醇勻漿（60 Hz，60 s）后，離心15 min（12000 g，4℃），取上清液待測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 兩組大鼠血壓比較

經(jīng)4周慢性應(yīng)激之后，CS組血壓顯著升高（P<0.01），符合慢性應(yīng)激高血壓的表現(xiàn)。見表2。

2.2 腺苷、cAMP含量測定

2.2.1 線性方程的建立

取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用50%甲醇稀釋，按1.4項(xiàng)下進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示不同濃度腺苷、cAMP與峰面積均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999。見表3。

2.2.2 精密度

測定低、中、高濃度腺苷、cAMP，計(jì)算精密度。腺苷精密度為0.48%～1.65%（n=6），cAMP精密度為0.96%～3.21%（n=6），說明方法精密度良好。

2.2.3 測定結(jié)果

將腦組織按照1.6項(xiàng)下處理，按1.4項(xiàng)下進(jìn)行測定，結(jié)果顯示CS組腺苷和cAMP的含量較Sham組顯著下調(diào)（P<0.01）。見表4。

3討論

腺苷具有舒張血管、對(duì)抗室上性心動(dòng)過速的作用。研究表明，腺苷與血流量大小密切相關(guān)，可通過與血管平滑肌的直接作用使血管舒張，血壓下降[5]。此外，腺苷可通過腺苷受體A2介導(dǎo)的Gαs使cAMP發(fā)生變化[6]。在本實(shí)驗(yàn)中，CS組腺苷和cAMP均下調(diào)，提示慢性應(yīng)激所致的高血壓可能與MAPK磷酸化程度相關(guān)。

本研究通過對(duì)腺苷、cAMP的靶向檢測，初步推斷CS所致高血壓可能與腺苷、cAMP的下調(diào)相關(guān)，并為今后研究慢性應(yīng)激性高血壓的病理機(jī)制提供一定參考。

參考文獻(xiàn)

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