魏 鳳，張文通，唐 娜，王 艷，管 宇，祖立闖，王金良，苗立中*，沈志強*(.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 56600；.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 56600)

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)是一種無囊膜的雙股DNA病毒，直徑大小為60～90 nm，屬于腺病毒科禽腺病毒屬。依據限制性內切酶消化模式與血清交叉中和試驗的不同，I群禽腺病毒(FAdV-I)又分為5個亞群(A-E)、12個血清型(FAdV1-11，其中FAdV-8分為a和b兩型)，可以引起禽類的多種疾病，包括包涵體肝炎、心包積液綜合征和雞胃糜爛[1-2]。雞肝炎-心包積液綜合征(Hepatitis and hydropericardium syndrome，HHS)是由禽腺病毒4型引起的主要侵害肉仔雞的一種病毒性傳染病。本病首次于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)發(fā)生[3]，隨后在亞洲、歐洲和南美洲等地區(qū)流行[4-5]。2015年以來該病在我國山東、江蘇、河南、安徽等地廣泛流行，可感染不同日齡、不同品種雞，發(fā)病死亡情況因地區(qū)、品種而異，對3～5周齡肉雞的致死率高達40%～100%，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經濟損失[6-9]。

目前，預防禽腺病毒病的根本措施是疫苗免疫[10]。有研究報道利用雞胚和雞胚原代肝細胞培養(yǎng)FAdV-4制備滅活全病毒油乳劑疫苗，并在臨床起到了較好的保護效果[11]。但該培養(yǎng)方法培養(yǎng)的病毒滴度較低，而且培養(yǎng)工藝繁瑣，不能滿足疫苗規(guī)?；a需要。篩選易培養(yǎng)、培養(yǎng)FAdV-4滴度高的細胞系，并對病毒培養(yǎng)特性進行研究，將有利于研發(fā)新型高效疫苗。本試驗通過用不同的細胞進行培養(yǎng)FADV-4濱州株從而篩選出最適應細胞株，并對其培養(yǎng)特性進行研究，以克服現有病毒增殖上存在的不足，為進一步開展禽腺病毒流行病學調查及疫苗毒株的培育提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

FADV-4濱州株由筆者分離保存； Vero細胞、QT-35細胞、DF-1細胞、LMH細胞均為本實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司、DMEM/F-12購自GIBCO公司；新生牛血清購自天津康源生物技術有限公司、胎牛血清購自Hyclone生物工程公司；胰酶為Sigma公司產品；核酸提取試劑盒和DNA Marker DL2000購自寶生物工程(大連)有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(MC015AC)購自山東愛博科技貿易有限公司、倒置顯微鏡(XDS-IB)購自重慶光電儀器有限公司、電熱恒溫培養(yǎng)箱購自黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司。

1.3 適應性細胞的篩選

將前期分離保存的FADV-4濱州株按1%比例分別接種長滿單層的LMH細胞、Vero細胞、QT-35細胞和DF-1細胞，同時設空白細胞對照，吸附1.5 h后補加細胞維持液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96 h，每天觀察細胞，待約85%細胞出現細胞病變時收獲，按此方法連續(xù)傳3代(F1-F3)。

LMH細胞、Vero細胞、QT-35細胞和DF-1細胞分別按1∶3的比例傳代時，細胞計數后，按1.5×105個/mL的細胞濃度，分別制備96孔細胞培養(yǎng)板，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。將其F3代培養(yǎng)物分別用DMEM做10倍系列稀釋(10-1～10-8)，接種對應的長滿單層的96孔細胞板中，每個稀釋度接種8個孔，0.1 mL/孔。同時設健康細胞對照。置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天觀察細胞病變情況。按照Reed-Muench法計算病毒含量(TCID50。)

1.4 LMH細胞的優(yōu)選、克隆優(yōu)化

將長滿單層的LMH細胞用0.25%的胰酶進行消化分散，細胞計數后，按15×104/mL的細胞數接種于T25細胞瓶中，輕輕搖勻后，放置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min后，棄去培養(yǎng)液，補加10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，重置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

將培養(yǎng)72 h的LMH細胞經胰酶消化、重懸后，添加15%胎牛血清的DM/F12培養(yǎng)基稀釋成10個細胞/mL，充分混勻后，加入96孔細胞培養(yǎng)板中，0.1 mL/孔，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d，更換新配制的15%胎牛血清的DM/F12培養(yǎng)基，0.2 mL生長液/孔，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 d，待細胞長滿單層后，選取單個細胞狀態(tài)良好的細胞，進行消化，計數。重復上述步驟，進行LMH細胞的克隆純化，直到獲得無細胞內雜質、透亮、輪廓清晰的細胞，液氮凍存一部分。同時進行傳代培養(yǎng)，待細胞能穩(wěn)定傳代后，進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，將培養(yǎng)基換成普通的DMEM，血清換成7%新生牛血清，同時添加0.5%雞血清，在恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.5.1 不同接毒劑量對TCID50的影響 將克隆優(yōu)化后的LMH細胞按常規(guī)方法進行傳代培養(yǎng)，按3×105/mL的細胞密度，制備出11瓶LMH細胞(T25)。待細胞長滿單層后，按不同接毒量接種病毒。共分5組，每組兩瓶。分別按1/100、 1/200、 1/400、 1/800、 1/1000接種病毒。同時設1瓶空白細胞對照。接種病毒后的細胞和對照細胞均放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細胞病變，當每瓶細胞有85%發(fā)生細胞病變時，收獲病毒液，置于-80 ℃冰箱中凍融3次。按此方法連續(xù)傳3代后，測定病毒含量，按照Reed-Muench法計算TCID50。分別計算每瓶毒液的TCID50，算出平均值，數據取lg值，用Excel軟件制圖。

1.5.2 不同吸附時間對TCID50的影響 將克隆優(yōu)化后的LMH細胞按常規(guī)方法進行傳代培養(yǎng)，按3×105/mL的細胞密度，制備出11瓶LMH細胞(T25)。待細胞長滿單層后，按1/1000接毒量接種病毒，分別置于37 ℃培養(yǎng)箱中吸附0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，然后加入含2%新生牛血清的DMEM維持液。同時設1瓶空白細胞對照。接種病毒后的細胞和對照細胞均放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細胞病變，當每瓶細胞有85%發(fā)生細胞病變時，收獲病毒液，置于-80 ℃冰箱中凍融3次。按此方法連續(xù)傳3代后，測定TCID50，方法同1.5.1。

1.5.3 不同收獲時間對病毒含量的影響 將克隆優(yōu)化后的LMH細胞按常規(guī)方法進行克隆傳代，按3×105/mL的細胞密度，制備出7瓶LMH細胞(T25)。待細胞長滿單層后，按1/1000接毒量接種病毒，分別置于37 ℃培養(yǎng)箱中吸附1 h，然后加入含2%新生牛血清的DMEM維持液。同時設1瓶空白細胞對照。接種病毒后的細胞和對照細胞均放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)至24 h、36 h、48 h時分別收獲2瓶接毒細胞，放置于-80 ℃冰柜凍融3次。按此方法連續(xù)傳3代后，測定TCID50，方法同1.5.1。

2 結果與分析

2.1 適應性細胞的篩選結果

FADV-4濱州株接種DF-1細胞盲傳三代無細胞病變可見，在LMH細胞、Vero細胞、QT-35細胞上均能看到明顯的細胞病變，其中在LMH細胞上接種24 h就有約60%的細胞出現細胞病變，36 h約有80%細胞出現細胞病變，病變特征主要表現為：細胞變圓、聚集成不規(guī)則葡萄串狀，細胞間隙增大。在Vero細胞和QT-35細胞上細胞病變出現的慢，培養(yǎng)48 h時約有50%細胞出現細胞病變，其病變特征為：細胞聚集、融合成合胞體(圖1)。在LMH、Vero和QT-35細胞上培養(yǎng)三代的病毒含量分別為107. 5TCID50/0.1 mL、104.875TCID50/0.1 mL、106. 25TCID50/0.1 mL(表1)。根據在不同細胞上培養(yǎng)時產生病變的時間、病變特征及病毒含量，確定LMH細胞為該毒株的最適宿主細胞。

表1 病毒適應性培養(yǎng)觀察及TCID50測定結果Table 1 Observation of virus adaptive culture and determination of TCD50

2.2 LMH細胞的克隆優(yōu)化結果

根據前面的試驗結果，LMH細胞較適宜該分離毒株的培養(yǎng)。但LMH細胞不易培養(yǎng)，優(yōu)化前需用專用培養(yǎng)基加胎牛血清、置5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。經過克隆、優(yōu)化培養(yǎng)后獲得了無細胞內雜質、透亮、輪廓清晰的細胞，細胞的生長速度和細胞密度都較優(yōu)化前有所提高，培養(yǎng)條件只需用DMEM培養(yǎng)基加新生牛血清、置恒溫電熱培養(yǎng)箱即可。

圖1 分離毒株在接種LMH細胞、Vero細胞、QT35細胞48h 細胞病變情況(100×) A．正常的LMH細胞；B.病毒感染的LMH細胞；C.正常的Vero細胞；D.病毒感染的Vero細胞； E.正常的QT35細胞；F.病毒感染的QT35細胞Fig. 1 Cytopathic condition of isolated virus strains inoculated with LMH cells, Vero cells and QT35 cells at 48h (100X) A. Normal LMH cells; B. Virus-infected LMH cells; C. Normal Vero cells; D. Virus-infected Vero cells; E. Normal QT35 cells; F. Virus-infected QT35 cells

2.3 FADV-4濱州株在LMH細胞上培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 不同接毒劑量對TCID50的影響結果 分別按接毒量為1/100、1/200、1/400、1/800、1/1000接種LMH細胞，于接毒后細胞病變達到約85%時收獲病毒液，測定TCID50。結果表明，最佳接毒量為1/1000(圖2)。

2.3.2 不同吸附時間對TCID50的影響結果 接種病毒后吸附1 h組的平均病毒含量可達108.125TCID50/0.1 mL。接毒后吸附0 h、0.5 h、1.5 h、2 h組的平均病毒含量均低于吸附1 h組的平均病毒含量，所以接毒后最佳吸附時間為1 h(見圖2)。

2.3.3 不同收獲時間對TCID50的影響結果 當接種后36 h收獲時病毒的毒價最高，平均值達到108.27/0.1 mL。24 h和48 h收獲時病毒毒價均低于36 h收獲時病毒毒價，由此確定該分離毒株的最佳收獲時間為接種后36 h(見圖2)。

圖2 培養(yǎng)條件優(yōu)化結果Fig.2 Optimization of culture conditions

3 討 論

一直以來，如何快速、高效的增殖病毒是疫苗研發(fā)生產中必須考慮的基本問題之一。由于傳統(tǒng)方式不能滿足需求，利用各類細胞增殖病毒成為疫苗研究者們關注的領域。細胞系生產疫苗具有生產成本低、操作簡單、對免疫動物機體副反應小等特點，最重要的是能克服SPF雞胚存在的缺點，避免了雞源性潛在疾病的感染。FAdV-I一般不感染異種動物，在其相應的細胞中生存繁殖不佳，因此采用禽源的細胞來培養(yǎng)本病毒效果最好，如雞胚或是雛雞腎細胞、雞胚或是雛雞肝細胞或者雞胚等。病毒感染的細胞一般會表現出明顯的細胞病變：細胞變圓成葡萄狀、折光性變強，最后細胞脫落[12]。本試驗選取了DF-1細胞、LMH細胞、Vero細胞、QT-35細胞培養(yǎng)FADV-4濱州株，結果發(fā)現該毒株在DF-1細胞上盲傳三代無細胞病變可見，在LMH細胞、Vero細胞、QT-35細胞上均能看到明顯的細胞病變。通過傳代培養(yǎng)、CPE觀察及病毒含量測定，最終篩選出CPE明顯，病毒含量高的病毒適應性細胞-LMH細胞。LMH細胞作為永生化細胞系，是通過化學藥物誘導正常細胞而建立的細胞系，不含任何外源病毒和致瘤基因，可以無限傳代，作為滅活疫苗的生產是安全的[13]。

本研究通過對LMH細胞進行克隆篩選及病毒培養(yǎng)特性研究，結果證明了雞源禽腺病毒可在LMH細胞上有效增殖并形成腺病毒特征性細胞病變，病毒含量最高可達到108.375TCID50/0.1 mL趙蕾等[14]研究證明FADV DC株在LMH細胞上增殖時，病毒含量可達107.5TCID50/0.1 mL。這與本實驗的結果相似。LMH細胞系屬于肝上皮細胞，而腺病毒傾向于感染上皮細胞，這可能與上皮細胞表達較高水平病毒受體有關。由于不同的毒株對不同的細胞感染能力不一樣，所以在具體實驗中需要摸索病毒的最佳增殖條件。

4 結 論

本研究通過克隆篩選、優(yōu)化培養(yǎng)，獲得一株易培養(yǎng)的LMH細胞，并且該細胞最適宜雞源4性禽腺病毒濱州株的培養(yǎng)，建立了禽腺病毒4型的細胞培養(yǎng)模型。該毒株的最佳增殖條件為:最佳接毒量為1/1000、接毒后最佳吸附時間為1 h、收毒時間為接毒后36 h。該研究為雞源禽腺病毒的分離、疫苗研究及疾病防控提供參考。