煙曲霉新基因pim1敲除菌株構(gòu)建及其耐藥功能鑒定

王凱杰，周哲倫，姜茹予，王晴晴，雷玉恬，王 莎

(湖州師范學院 醫(yī)學院、護理學院，浙江 湖州 313000)

近年來，隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等的廣泛應用甚至濫用，以及器官移植和外科介入性治療，菌群失調(diào)以致機體對真菌的抵抗力降低，侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)感染的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，成為了器官移植手術(shù)、白血病等重癥免疫受損患者死亡的主要原因，病死率高達60%～100%[1-3].目前，治療深部曲霉感染的臨床應用一線藥物是三唑類抗真菌藥物(trizoles)，如伊曲康唑(itraconazole)、伏立康唑(voriconazole)和泊沙康唑(posaconazole)[3-4].唑類藥物通過與麥角固醇合成途徑中的關(guān)鍵酶細胞色素P450羊毛甾醇14α-脫甲基酶(Erg11A/Cyp51A基因編碼)結(jié)合，以抑制麥角固醇的合成并造成毒性固醇中間體的積累，從而抑制真菌的生長[5].然而，研究發(fā)現(xiàn)越來越多的臨床分離菌對唑類藥物會產(chǎn)生耐藥性[6-7].因此，煙曲霉的耐藥機制已經(jīng)成為當前研究的一個重要領(lǐng)域.

本實驗室前期建立了以根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的T-DNA(Transfer DNA)隨機插入的煙曲霉突變菌株庫，其中編號為T478號的煙曲霉菌株對伊曲康唑耐藥.本研究以T478號菌株為出發(fā)菌株，利用Tail-PCR技術(shù)擴增該突變體中被T-DNA破壞的基因片段，并通過測序鑒定到該突變基因，進一步利用基因敲除技術(shù)在野生型菌株中敲除該基因，以觀察驗證該基因是否參與對伊曲康唑耐受性的調(diào)控.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煙曲霉野生型菌株A1160來自FGSC(http://www.fgsc.net/)，A1160c野生型對照菌株來自本實驗室菌庫，pim1插入突變菌株(T478)和敲除菌株(Δpim1)為本實驗構(gòu)建.本研究所用培養(yǎng)基為YAG豐富培養(yǎng)基(每升含酵母粉5 g、葡萄糖20 g、微量元素Trace elements 1 mL，固體培養(yǎng)基需加入2%瓊脂粉)和YUU培養(yǎng)基(在YAG豐富培養(yǎng)基中再添加1.1 g/L尿苷Uridine和1.2 g/L尿嘧啶Uracil).Trace elements的配方：每升含ZnSO4·7H2O 22 g、H3BO311 g、MnCl2·4H2O 5 g、FeSO4·7H2O 5 g、CoCl2·5H2O 1.6 g、CuSO4·5H2O 1.6 g、(NH4)6MO7O24·4H2O 1.1 g、EDTA 50 g，加熱并用KOH調(diào)節(jié)pH至6.5～6.8.本研究菌株的培養(yǎng)條件為37 ℃下培養(yǎng)48 h.

主要試劑：酵母抽提物(Yeast Extract)購自O(shè)xiod公司(英國)；葡萄糖購自生工生物工程(上海)股份有限公司(中國)；各種無機鹽購自國藥集團試劑化學有限公司(中國)；DMSO購自北京索萊寶科技有限公司(中國)；伊曲康唑ITC購自南京森貝伽生物科技有限公司(中國).本實驗用到的試劑均為粉末，純度>99%.分子生物學PCR和Tail-PCR相關(guān)試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(中國).

1.2 Tail-PCR

TAIL-PCR，即交錯式熱不對稱PCR或巢氏PCR：設(shè)計3個嵌套的特異性引物(pPK2-RB1、pPK2-RB2、pPK2-RB3)分別與簡并引物(AD1、AD2、AD3和AD4)組合進行連續(xù)的PCR循環(huán)(表1)，利用不同的退火溫度選擇性地擴增目標片段，一般通過3次巢式PCR反應即可獲取已知序列的側(cè)翼序列，所獲得的片段可通過測序得到被插入破壞的基因序列.

1.3 基因敲除

本研究采用PCR方法擴增,用于轉(zhuǎn)化入菌株的DNA片段.其中，引物Pim1 P1和Pim1 P3擴增pim1基因的上游同源臂，引物Pim1 P4和Pim1 P6擴增pim1基因的下游同源臂，引物Pim1 P2和Pim1 P5將上下游同源臂片段和篩選標記基因進行整合.本研究使用的所有引物見表1，均由金斯瑞生物科技股份有限公司(中國)合成.

表1 本研究所用引物

2 結(jié) 果

2.1 伊曲康唑耐藥突變菌株T478號的篩選

本研究前期以野生型親本A293為出發(fā)菌株，建立了一個大于2 000株根癌農(nóng)桿菌介導的T-DNA隨機插入的煙曲霉突變菌株庫，并利用瓊脂稀釋法對該突變菌株庫中的菌株進行了伊曲康唑的耐藥篩查，最終得到8株伊曲康唑耐藥菌株.本文從8株伊曲康唑耐藥菌株中選取1株比較典型的T478號菌株作為出發(fā)菌株.如圖1所示,在正常的培養(yǎng)條件下，T478號菌株的菌落直徑比其野生型親本Af293要小，但經(jīng)伊曲康唑處理后，其菌落直徑明顯大于野生型菌株，表明T478號菌株對伊曲康唑耐藥.

圖1 伊曲康唑耐藥T478號菌株Fig.1 Itraconazole-resistant T478 strains

2.2 T478號菌株突變基因的鑒定

將T478號菌株作為候選目標菌株，設(shè)計引物利用Tail-PCR技術(shù)對T478號菌株基因組上T-DNA的側(cè)翼序列進行分離測序鑒定，結(jié)果在該菌株的基因組中，T-DNA左臂的側(cè)翼序列擴增測序未得到目的基因，而T-DNA右臂的側(cè)翼序列擴增測序得到一個未被研究的新基因，該基因的登錄號為locus_tag="AFUA_2G11740".圖2為T-DNA右臂的插入模式：插入到AFUA_2G11740基因開放閱讀框內(nèi)的一個外顯子區(qū)域內(nèi)，即插入到從起始密碼子開始的第1 586個堿基處.因此，推測T478號菌株對伊曲康唑耐藥可能與該基因功能被破壞存在密切關(guān)系.

據(jù)研究報道，該基因在酵母菌中的同源蛋白被預測為線粒體絲氨酸蛋白酶Pim1(mitochondrial serine protease Pim1, putative).Pim1蛋白酶是存在于酵母菌線粒體基質(zhì)中的Lon類蛋白酶的另一種命名(Pim1 refers to mitochondrial ATP-dependent protease protein).

注：斜體字母為T-DNA右邊界序列,斜體字母和粗體GA為T-DNA 右邊界斷裂位點,帶有下劃線的字母為基因AFUA_2G11740的片段.圖2 T478號菌株的T-DNA插入模式推測圖Fig.2 Speculative diagram of T-DNA insertion pattern of strain T478

注：(a)為左(泳道2)右(泳道3)同源臂和中間的pyr4片段(泳道1)， (b)為融合的全長片段(泳道1).圖3 pim1基因敲除的融合片段電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of pim1 knockout fusion fragment

2.3 Δpim1菌株的構(gòu)建

本文通過融合PCR技術(shù)，根據(jù)同源重組替換目的基因的原理構(gòu)建煙曲霉pim1敲除菌株.首先用引物Pim1 P1/P3和Pim1 P4/P6分別擴增長度約為0.8 kb的pim1基因上下游同源臂，然后用引物pyr4 F/R從質(zhì)粒pAL5上擴增2.2 kb篩選標記pyr4基因(圖3(a))，再將上述3個片段混合作為模板，用引物Pim1 P2/P5將左同源臂、篩選標記和右同源臂整合成一個3.9 kb的融合片段(圖3(b))，最后將融合片段轉(zhuǎn)入野生型A1160菌株的細胞中，經(jīng)基因同源重組后，pim1基因被pyr4基因替換，在篩選培養(yǎng)基上得到煙曲霉pim1缺失的敲除菌株.

2.4 Δpim1菌株耐藥表型的驗證

前期研究發(fā)現(xiàn)，pim1基因被T-DNA插入破壞后會導致突變菌株對唑類藥物耐藥.由圖4可以看出，在正常情況下，野生型菌株的菌落直徑大于Δpim1基因敲除菌株，當加入0.5 μg/mL伊曲康唑后，野生型菌株生長明顯受到抑制，Δpim1基因敲除菌株的菌落直徑遠遠大于野生型菌株.由此表明，Δpim1基因敲除菌株具有與T478號菌株相同的耐藥表型，這進一步證實了前期菌株篩選和基因分離鑒定的準確性，也驗證了pim1基因參與煙曲霉耐藥功能的調(diào)控.

圖4 Δpim1對唑類藥物耐藥的菌落表型Fig.4 Colony phenotypes of Δpim1 resistant to azole drugs

3 討 論

本文從T-DNA隨機插入的煙曲霉突變菌株庫中篩選出T478號耐唑類藥物突變菌株，并通過Tail-PCR技術(shù)鑒定到一個煙曲霉新基因pim1.為驗證pim1基因的缺失是否與煙曲霉的耐藥性存在直接關(guān)系，本研究在煙曲霉野生型親本A1160株中敲除pim1基因，獲得了Δpim1敲除菌株，并通過菌落表型鑒定發(fā)現(xiàn)，Δpim1具有與突變菌T478號相同的耐伊曲康唑表型.后期進一步研究發(fā)現(xiàn)，pim1基因的缺失并沒有引起對棘白菌素類藥物卡泊芬凈的耐受，僅表現(xiàn)為對伊曲康唑耐藥.

Lon類蛋白酶的基因名稱最早來自大腸桿菌Lon基因的突變表型(These mutants tend to grow in long forms)，該表型是由細菌在紫外線照射后形成的不分裂的長線狀結(jié)構(gòu)[8].Lon蛋白酶在原核生物的胞質(zhì)及真核生物的線粒體中都高度保守，在高溫、缺氧、損傷等應激情況下，Lon蛋白酶都呈高表達.許多研究表明，Lon蛋白酶定位于線粒體基質(zhì)中參與線粒體DNA代謝,以維持前體mRNA穩(wěn)定性，能夠通過介導異?；驌p傷的蛋白和短暫調(diào)控蛋白的降解來維持細胞線粒體的正常生理功能和細胞自身的體內(nèi)平衡[9].它也是一種分子伴侶，參與線粒體蛋白的折疊和去折疊[10].關(guān)于煙曲霉耐藥的最新研究發(fā)現(xiàn)，線粒體呼吸鏈復合體結(jié)構(gòu)中的Cox10蛋白突變后，線粒體有氧呼吸能力減弱，同時胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)鈣離子震蕩，鈣離子信號通路被激活，并進一步激活下游細胞壁整合通路和藥物外排泵基因表達，最終實現(xiàn)對唑類藥物耐受.因此，推測Pim1蛋白在煙曲霉中參與唑類藥物耐受的調(diào)控可能是通過類似Cox10的作用機制實現(xiàn)的，后期可圍繞該蛋白對線粒體功能的影響展開研究.

目前，人們對臨床菌株耐藥機制的認知還很淺，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)臨床上分離的耐藥菌株存在多種未知機制，而絲狀真菌中pim1基因參與耐藥調(diào)控的功能還沒有被研究，后期的研究可利用成功構(gòu)建的Δpim1菌株，進一步深入研究pim1在煙曲霉細胞中參與唑類藥物耐藥的分子調(diào)控機制，為理解和控制真菌的耐藥性提供依據(jù).