鐘明浩，黃裕春，關(guān)海艦，謝文聰，梁漢成，麥偉珍，葉小華，鐘新光

（1.東莞市第六人民醫(yī)院，廣東東莞 523000；2.東莞市中心血站，廣東東莞 523000；3.廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510310）

結(jié)核病是一種嚴重危害人群健康的呼吸道傳染病，在人群中流行和傳播可能產(chǎn)生新的結(jié)核病患者，同時也可能會產(chǎn)生新的結(jié)核桿菌潛伏感染者，潛伏感染者可在一定條件下發(fā)病成為結(jié)核病患者。據(jù)估計，全世界有四分之一至三分之一的人口可能感染結(jié)核分枝桿菌[1]，因此對潛伏感染群體的篩查有重要意義。最新數(shù)據(jù)表明[2]，廣東省流動人口達到五千萬。據(jù)報道[3]，在肺結(jié)核整體發(fā)病率下降的同時，流動人口的發(fā)病率出現(xiàn)了上升趨勢。流動人口活動范圍大，接觸人群廣，是肺結(jié)核的高危人群。傳統(tǒng)結(jié)核桿菌潛伏感染的檢測依賴結(jié)核菌素皮膚試驗，該方法實際應(yīng)用具有一定的局限性，而國外的γ-干擾素釋放試驗相關(guān)試劑價格昂貴，限制了在人群中的大規(guī)模應(yīng)用。近年來，國內(nèi)研發(fā)多種結(jié)核潛伏感染檢測試劑，如蛋白芯片以及γ-干擾素檢測試劑，但這些試劑缺乏在不同人群中的大規(guī)模評估。本研究選取華大IgG抗體檢測試劑盒、普瑞康IgG抗體檢測試劑盒、希格T細胞檢測試劑盒、迪澳T細胞檢測試劑盒共4種國產(chǎn)試劑，分別與世界衛(wèi)生組織推薦的QuantiFERON-TB（QFT）試驗檢測試劑進行比較分析。

1 對象與方法

1.1 一般資料

研究對象為未被診斷為活動性肺結(jié)核的人群，選取符合納入標準的研究對象共1 200人，研究對象均知情同意。其中男性738人，女性462人；年齡中位數(shù)35歲，四分位距12歲，最小年齡18歲，最大年齡62歲；20歲以下35人，20~40歲766人，40歲及以上399人。進行結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測的適用樣本為血清，標本采集時不加抗凝劑，自然凝血，要求標本清亮、無溶血。進行γ-干擾素釋放試驗檢測的標本為肝素抗凝血標本，不得使用EDTA抗凝，室溫15~25℃運輸和保存，不得冷藏或冷凍。

1.2 主要儀器和試劑

TS-1000恒溫振蕩器（常州金壇精達儀器制造有限公司）、AE-1000生物芯片閱讀儀（北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司）；結(jié)核分枝桿菌IgG抗體譜檢測試劑盒（微陣列酶聯(lián)免疫法，北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司）；結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光蛋白芯片法，深圳市普瑞康生物技術(shù)有限公司）；結(jié)核感染T細胞釋放γ-干擾素檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫斑點法，廣東希格生物科技有限公司）；SPOTest檢測試劑盒（廣州迪澳生物科技有限公司）。

1.3 方法

對采集的樣本分別使用4種方法進行檢測，與QFT檢測結(jié)果進行比較分析。

1.3.1 華大IgG抗體譜檢測試劑盒4種重組抗原16 kDa、38 kDa、Ag85B和MPT64以特定微陣列的形式排布在微孔板內(nèi)，板孔中加入待測血清樣本溫育反應(yīng)、洗滌最后加入發(fā)光液。若樣本中含有一種或多種針對上述幾種抗原的抗體，其特異性相對應(yīng)的抗原點會產(chǎn)生發(fā)光信號。陽性對照發(fā)光信號值應(yīng)>500，陰性對照發(fā)光信號值應(yīng)<150。

1.3.2 普瑞康IgG抗體檢測試劑盒 基于化學(xué)發(fā)光蛋白芯片技術(shù)檢測血清中的TB-IgG。將16 kD、38 kD和LAM等5種抗原固定在醛基化玻片片基上制備成蛋白芯片，用來捕捉被測血清樣本中上述結(jié)核抗原的IgG抗體，利用抗人IgG的酶標抗體來測定樣本中的TB-IgG。

1.3.3 希格γ-干擾素檢測試劑盒 經(jīng)適當(dāng)分離、處理的外周血單個核細胞（PBMCs）與結(jié)核分枝桿菌特異性抗原一起加入到預(yù)包被抗γ-干擾素抗體的PVDF膜微孔中，培養(yǎng)一段時間。分泌出的γ-干擾素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲，通過顯色底物使其在反應(yīng)部位形成不溶性斑點。每一個斑點代表1個γ-干擾素分泌結(jié)核特異效應(yīng)T細胞。記數(shù)斑點數(shù)量可以獲得外周血中結(jié)核特異的效應(yīng)T細胞數(shù)量。

1.3.4 迪澳SPOTest檢測試劑盒 在檢測時，將人外周血T淋巴細胞與致病性結(jié)核外周血結(jié)核桿菌刺激物在預(yù)包被了抗人IFN-γ的細胞培養(yǎng)板上共培養(yǎng)，經(jīng)過酶聯(lián)免疫顯色，通過目測或使用放大鏡等計數(shù)斑點。每個斑點代表一個分泌細胞因子的效應(yīng)T細胞，計數(shù)斑點數(shù)量可以獲得外周血中結(jié)核特異性T細胞的數(shù)量，進而判斷機體是否存在結(jié)核分枝桿菌特異性的免疫反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，一般資料以中位數(shù)和四分位距表示，不同檢測方法間進行一致性檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用診斷試驗評價4種國產(chǎn)試劑的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值、陽性似然比和陰性似然比、約登指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 檢測試劑盒檢測陽性率

選取1 200例研究對象標本檢測，其中華大IgG抗體檢測試劑盒、普瑞康IgG抗體檢測試劑盒、希格T細胞檢測試劑盒檢測結(jié)果陽性率分別為0.92%、13.5%、12.42%，均低于QFT檢測法（P<0.01）。迪澳T細胞檢測試劑盒陽性率32.42%，高于QFT檢測法（P<0.01），見表1。

表1 4種國產(chǎn)檢測試劑盒與QFT檢測結(jié)果比較Table 1 Comparison of four domestic test kits and QFT test results

2.2 一致性檢驗

結(jié)果顯示，華大IgG抗體檢測試劑盒與QFT的Kappa值為0.034，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示兩種方法檢測結(jié)果具有一致性。普瑞康IgG抗體檢測試劑盒與QFT的Kappa值為0.013，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示兩種方法檢測結(jié)果不一致。希格T細胞檢測試劑盒與QFT的Kappa值為0.511，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示2種方法檢測結(jié)果具有一致性。迪澳T細胞檢測試劑盒與QFT的Kappa值為0.699（一致性最高），且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示2種方法檢測結(jié)果具有一致性，見表2。

表2 4種檢測方法的一致性檢驗Table 2 Consistency test of four testing methods

2.3 靈敏度和特異度檢驗

以QFT檢測方法為標準，對4種國產(chǎn)檢測方法進行靈敏度和特異度的檢驗，結(jié)果顯示，華大IgG抗體試劑盒靈敏度和特異度分別為2.67%、99.67%，普瑞康IgG抗體試劑盒靈敏度和特異度分別為14.33%、86.78%，希格T細胞檢測試劑盒靈敏度和特異度分別為44.33%、98.22%，迪澳T細胞檢測試劑盒靈敏度和特異度分別為90.00%、86.78%，其他評價指標見表3。

表3 4種檢測方法的診斷試驗分析結(jié)果Table 3 Analysis of the diagnostic value of four detection methods

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的慢性傳染性疾病，2020年全球結(jié)核報告顯示[4]，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者約996萬，死亡約121萬。全球結(jié)核潛伏感染人群接近20億，大約5%~10%會發(fā)展為結(jié)核病患者。結(jié)核潛伏感染（LTBI）病例被定義為對結(jié)核分枝桿菌持續(xù)免疫反應(yīng)的狀態(tài)，沒有臨床上證明的活動性結(jié)核病證據(jù)。美國境內(nèi)發(fā)生的結(jié)核病傳播也表明[5]，超過85%的結(jié)核病病例來自潛在結(jié)核病感染的重新激活。識別結(jié)核潛伏感染者是結(jié)核病控制的一個重要組成部分[6]。因此，為了實現(xiàn)2035年終止結(jié)核，就必須解決結(jié)核潛伏感染問題。

由于沒有診斷LTBI的黃金標準測試，因此評估LTBI的真實流行率和診斷測試的準確性具有挑戰(zhàn)性。準確識別和治療LTBI對于結(jié)核病的控制和消除至關(guān)重要。缺乏診斷LTBI的黃金標準意味著該疾病的真正流行率未知，并且對診斷測試的敏感性和特異性的估計帶來偏差[7]。在一項對QFT和TST（tuberculin skin test，結(jié)核菌素皮膚試驗）檢驗效能的測試中，發(fā)現(xiàn)QFT比TST有更高的特異性，甚至在免疫功能低下的受試者中，都有著高度可比的結(jié)果。與TST相比，QFT陽性與結(jié)核病感染風(fēng)險一致[8]，而且在QFT值為負的受試者中結(jié)核病發(fā)展的風(fēng)險也非常低[9]。但QFT檢測成本高，且實驗室密集型QFT測試仍然有限或不可用[10-11]。因此，為探索能大規(guī)模應(yīng)用于日常檢測的測試方法，本次研究選取了4種檢測試劑盒，通過與QFT進行比較分析，得到成本低、特異性高、診斷陽性率高的檢測技術(shù)。

華大IgG抗體檢測試劑盒（微陣列酶聯(lián)免疫法）是集成酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）技術(shù)和微陣列（Array）技術(shù)形成的新一代檢測技術(shù)體系。在保持了ELISA方法學(xué)的成熟、方便、敏感性及特異性都較為良好的基礎(chǔ)上，又具有微陣列技術(shù)的高通量、低成本、高平行、微型化等特點[12]。本次研究結(jié)果顯示，與國際推薦的QFT檢測結(jié)果25.00%相比，華大IgG抗體檢測試劑盒檢驗陽性率只有0.92%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），這與另外一項研究[10]的陽性率結(jié)果相近（1.25%）。

普瑞康IgG抗體蛋白芯片是一種能夠簡便快速診斷肺結(jié)核的方法，通過測定人血清中特異性的結(jié)核分枝桿菌抗體來診斷肺結(jié)核，通過多種抗原對應(yīng)抗體互補，彌補了其他方法檢測漏檢的不足。一項研究發(fā)現(xiàn)[13]，在組合蛋白抗原與血清的作用中，陽性率（12.7%）高于單獨抗原蛋白的陽性率（7.6%）。本研究結(jié)果表明，普瑞康IgG抗體檢測試劑盒陽性率13.50%，與國際推薦的QFT檢測結(jié)果25.00%相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。陽性率較低可能與此檢測方法本身性質(zhì)有關(guān)，對于所選人群中免疫低下的研究對象，可能降低了其陽性率。

希格T細胞檢測試劑盒所用方法屬酶聯(lián)免疫斑點法，與傳統(tǒng)的結(jié)核菌素皮試試驗相比，該方法不受卡介苗（BCG）接種的影響，特異性檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（人型、牛型、非洲型）引起的結(jié)核感染。另外，檢測結(jié)果一次就能獲得，患者無須返回觀察，實驗室質(zhì)量控制更為容易。有研究標明[14]，在健康人群中，酶聯(lián)免疫斑點干擾素釋放試驗的陽性率為16.7%。本研究結(jié)果顯示，希格T細胞檢測試劑盒陽性率12.42%，低于國際推薦的QFT檢測結(jié)果25.00%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。由于受試者身體狀況的原因（如HIV感染、糖尿病、使用免疫抑制劑治療等）造成免疫功能下降甚至喪失，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

迪澳T細胞檢測試劑盒所用方法屬酶聯(lián)免疫斑點法，于體外定性檢測外周靜脈抗凝血中結(jié)核分枝桿菌特異性的T細胞免疫反應(yīng)。酶聯(lián)免疫斑點法在淋巴結(jié)核和肺結(jié)核等檢測中，均具有較高的陽性率，能更敏感的檢測出早期或者既往感染的患者，是作為診斷肺結(jié)核的重要輔助依據(jù)[15]。有報道表明[16]，酶聯(lián)免疫斑點檢測法在潛伏組的檢測中，陽性率為31.0%，本研究結(jié)果顯示，希格T細胞檢測試劑盒陽性率32.42%，高于國際推薦的QFT檢測結(jié)果25.00%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

通過分析4組檢測方法的一致性，均以世界衛(wèi)生組織推薦的QFT檢測結(jié)果為評價標準，其中迪澳T細胞檢測試劑盒檢測方法Kappa值>0.6，一致性較好，希格T細胞檢測試劑盒檢測方法Kappa值<0.4，一致性中等，其他Kappa值均>0.4，一致性較差。通過對4種檢測方法的靈敏度和特異度檢驗，迪澳T細胞檢測試劑盒具有最高的靈敏度和特異度，能更準確地檢測到陽性對象，減少漏診的情況，但本次研究對象的陽性預(yù)測值略低，可能受到人群差異和實驗室操作等因素的影響，應(yīng)加大篩查人群，進一步探究其檢驗效能。本次研究迪澳T細胞檢測試劑盒陽性率檢出在4種檢測方法中最高，與其他相關(guān)研究結(jié)果[17]相近。

目前對于LTBI，仍缺乏大規(guī)模篩查檢測技術(shù)，雖然世界衛(wèi)生組織推薦QFT，但仍存在許多不足之處，比如，價格昂貴[18]，不同人群檢驗效能的差異。有研究表明[19]，對于接種了卡介苗的個體來說，QFT具有更高的特異性和靈敏性。但在未接種卡介苗人群中診斷LBTI的QFT效能可能不如TST。此外本次選取的4種檢測方法，結(jié)果仍受到多方面的因素影響，包括免疫功能低下可能為陰性，只能用于血清樣本的檢測而不能用于檢測其他體液樣本等，這些都會制約大規(guī)模開展篩查來發(fā)現(xiàn)LTBI。因此，應(yīng)綜合考慮實際情況，選擇具有更好預(yù)測價值的篩選方法或開展更大規(guī)模的科學(xué)實驗進行驗證。