張三利，盛明月，吳 琪，陳 遜，俞 妍，寇俊萍，陳剛領(lǐng)

（中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198）

卒中已成為繼癌癥和心血管疾病之后的全球第三大疾病，嚴重威脅公眾健康，其中缺血性卒中占比＞80%［1-2］。在哺乳動物中，晝夜節(jié)律是生物適應(yīng)溫度和光照等環(huán)境因素規(guī)律變化而演化的內(nèi)在自主計時機制。研究表明，多種心腦血管疾病包括缺血性卒中的發(fā)病率均具有晝夜節(jié)律特征［3-4］。

時鐘基因的蛋白產(chǎn)物在多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，在神經(jīng)退行性疾病中，Bmal1的蛋白產(chǎn)物可通過生存激酶（survival kinase）發(fā)揮對晝夜節(jié)律發(fā)揮調(diào)節(jié)和維持作用，且Bmal1的表達與神經(jīng)元存活呈正相關(guān)［5］。此外有研究表明，在牙齦卟啉單胞菌誘導動脈粥樣硬化的發(fā)病進程中，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）/NF-κB信號通路被激活，抑制了時鐘基因Bmal1轉(zhuǎn)錄，進而增強人主動脈內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而加劇疾病的進展［6］。魯斯可皂苷元（ruscogenin，Rus）又稱為假葉樹苷元，屬甾體皂苷元，由中藥麥冬中提取獲得。研究發(fā)現(xiàn)，Rus具有顯著的抗炎抗血栓活性［7-8］。此外，Rus可通過抑制NF-κB和硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）介導的腦部炎癥反應(yīng)，減輕小鼠腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［9-10］。但是Rus與時鐘基因的關(guān)系尚未見報道。本研究采用大腦中動脈線栓法制備小鼠I/R模型，評價Rus對I/R小鼠腦I/R損傷的改善作用，同時考察Rus對模型小鼠大腦皮質(zhì)時鐘基因表達的影響，以期探討減輕腦I/R損傷與調(diào)控腦皮質(zhì)時鐘基因表達的相關(guān)性，為進一步闡釋腦I/R損傷的晝夜節(jié)律特征提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

Rus（純度≥98%，成都普思生物科技有限公司）。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride solution，TTC）（美國Sigma公司）；兔抗小鼠Per1，Bmal1和Clock多克隆抗體（武漢愛博泰克公司）；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體和山羊抗兔IgG抗體（美國Birworld公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；組織總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）。

多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；EPS-600數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海天能科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad公司）。

1.2 動物

健康SPF級雄性C57BL/6J小鼠，2月齡，體重20～25 g（河南斯克貝斯生物科技股份有限公司），許可證號SCXK（豫）2020-0005。所有小鼠飼養(yǎng)于食物、飲水充足的人工控制光暗環(huán)境的恒溫飼養(yǎng)箱中。飼養(yǎng)箱溫度25℃，濕度30%～60%，光照強度200 lx，12 h/12 h光暗周期，每天6∶00-18∶00燈光照明。實驗開始前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)≥2周，動物實驗經(jīng)中國藥科大學動物倫理委員會批準（批準號：202011004）。

1.3 動物分組和l/R模型制備

將小鼠隨機分為4組：假手術(shù)組、假手術(shù)組+Rus組、I/R組和I/R+Rus組。假手術(shù)+Rus組和I/R+Rus組小鼠在術(shù)前1 h ig給予Rus 10 mg·kg-1，假手術(shù)和I/R組給予同體積溶媒（0.5%羧甲纖維素鈉）。I/R組和I/R+Rus組均采用線栓法復制小鼠I/R模型。小鼠ip給予4%的水合氯醛麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，在頸部正中作一定長度的切口，輕柔地分離出右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）和頸外動脈（external carotid artery，ECA）。在靠近ECA分叉處約3 mm作一切口，緩慢將線栓沿ECA插入到ICA，當線栓頭部插入的深度距離ECA與ICA分叉處9～10 mm且感到阻力時即停止進栓，缺血1 h后，拔出線栓實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組小鼠僅分離CCA，ICA和ECA，但不插線。選擇造模成功的小鼠用于實驗。模型成功的判定標準為：小鼠麻醉蘇醒后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征；缺血一側(cè)大腦的對側(cè)肢體出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，且以前肢為重；小鼠出現(xiàn)跛行或?qū)?cè)肢體屈曲內(nèi)收，爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈［12］。

1.4 神經(jīng)功能評分

再灌注24 h后，采用24分制評分表對小鼠進行神經(jīng)行為評分［11-12］，評分項目主要有：①身體對稱。正常（0分）、向一側(cè)傾斜（1分）、中度不對稱（2分）、明顯不對稱（3分）、極度不對稱（4分）。② 步態(tài)。正常（0分）、行走僵硬、不靈活（1分）、跛行（2分）、顫抖（3分）、無法行走（4分）。③ 轉(zhuǎn)圈行為。正常（0分）、主要轉(zhuǎn)向一側(cè)（1分）、不總是向一側(cè)轉(zhuǎn)圈（2分）、總是向一側(cè)轉(zhuǎn)圈（3分）、旋轉(zhuǎn)或無法移動（4分）。④攀爬行為。正常（0分）、沿著斜面攀爬（1分）、抓住斜面（2分）、滑下斜坡，防止跌倒行為失敗（3分）、立即滑下斜坡，無防止跌倒行為（4分）。⑤前肢對稱。正常（0分）、輕微不對稱（1分）、中度不對稱（2分）、明顯不對稱（3分）、前肢不對稱且肢體或身體無法移動（4分）。⑥強迫轉(zhuǎn)圈。正常（0分）、傾向轉(zhuǎn)向一邊（1分）、向一側(cè)轉(zhuǎn)圈（2分）、緩慢地向一邊轉(zhuǎn)圈（3分）、無法前進（4分）。

1.5 組織樣本收集和處理

待神經(jīng)功能評分完成后，ip給予4%水合氯醛麻醉小鼠，生理鹽水心臟灌流至肝發(fā)白，取完整大腦，部分（n=8）用于TTC染色評價腦梗死體積，部分（n=3）置于-80℃冰箱保存，取皮質(zhì)組織用于實時熒光定量PCR和Western印跡實驗。

1.6 TTC染色觀察腦組織梗死體積

將小鼠右側(cè)完整大腦制成厚度為2 mm的冠狀腦切片，浸泡于1%TTC 3～4 mL中，37℃恒溫避光放置15 min。腦片正常區(qū)域被染成紅色，梗死區(qū)域為白色。將腦切片轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛溶液中固定24 h后拍照。本研究采取右大腦中動脈栓線法制備腦I/R模型，僅右側(cè)腦出現(xiàn)梗死。實際梗死體積=右側(cè)腦體積-右側(cè)腦無梗死體積。右側(cè)腦無梗死體積由Image J軟件分析獲得，視左側(cè)腦與右側(cè)腦等體積的前提下，右側(cè)腦梗死體積百分比（%）=（左側(cè)腦體積-右側(cè)腦無梗死體積）/左側(cè)腦體積×100%。

1.7 實時熒光定量PCR法測定右側(cè)梗死皮質(zhì)組織Per1，Clock和Bmal1 mRNA表達水平

取-80℃保存的右側(cè)梗死皮質(zhì)組織25 mg，用Trizol提取總 RNA，測定A260nm/A280nm為 1.8～2.0。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此模板進行PCR擴增。Per1基因引物上游序列：5′-CAGCCGTGCTGCCTACTCATT-3′；下游序列：5′-AGAGGCAGCTTGGTGTGTGTC-3′。Bmal1基因引物上游序列：5′-CCAAGAAAGTATGGACACAGACAAA-3′；下游序列：5′-GCATTCTTGATCCTTCCTTGGT-3′。Clock基因引物上游序列：5′-CCTATCCTACCTTCGCCACACA-3′；下游序列：5′-TCCCGTGGAGCAACCTAGAT-3′。GAPDH基因引物上游序列：5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′；下游序列：5′-GTCTTCTCTGAATGGGCCAG-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴增條件為：95℃ 10 min，95℃15 s，60℃ 1 min，40循環(huán)。使用QuantStudio 3儀器實時熒光定量分析，以 2-△△Ct法計算Per1，Clock和Bmal1mRNA相對表達水平。

1.8 Western印跡法檢測小鼠右側(cè)梗死皮質(zhì)組織Per1，Clock和Bmal1 蛋白表達

取-80℃保存的小鼠右側(cè)梗死皮質(zhì)組織，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定其濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h；加入一抗（稀釋比例：Per1 1∶1000，Bmal1 1∶800，Clock 1∶1000，GAPDH 1∶10 000）4℃過夜；TBST洗膜，5 min，3次；加入適量二抗（稀釋比例1∶6000），常溫孵育2 h；TBST洗膜，5 min，3次。使用增強型發(fā)光試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)Image lab圖像分析軟件進行測定，以目標蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度值的比值表示蛋白相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Rus對腦l/R損傷小鼠神經(jīng)功能評分和腦死梗體積的影響

如圖1所示，I/R組行為學評分和梗死體積高于假手術(shù)組（P＜0.01）；與I/R組相比，I/R+Rus組行為學評分和梗死體積顯著減?。≒＜0.01）。

Fig.1 Effect of ruscogenin（Rus）on neurological deficit score（A）and cerebral infarction volume（B）of mice with cerebral ischemia/reperfusion（l/R）injury.B2 was the semi-quantitative result of B1.Mice were randomly divided into sham group，sham+Rus group，I/R group and I/R+Rus groups.Mice were ig Rus 10 mg·kg-1（in drug group）or 0.5% sodium carboxymethyl cellulose（in sham and I/R group）1 h before middle cerebral artery occlusion.The normal part of the right hemisphere brain was detected by Image J software.The percentage of right hemisphere brain infract volume(%)＝(the volume of the left hemisphere brainthe normal part of the right hemisphere brain)/the volume of the left hemisphere brain×100%.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with I/R group.

2.2 Rus對腦l/R損傷小鼠Per1，Clock和Bmal1 mRNA水平的影響

RT-qPCR檢測結(jié)果如圖2所示，與假手術(shù)組相比，I/R組Per1，Clock和Bmal1mRNA表達水平均顯著下調(diào)（P＜0.01）；與I/R組相比，I/R+Rus組Per1，Clock和Bmal1mRNA表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.2 Effect of Rus on mRNA levels of Per1，Clock and Bmal1 in mice with cerebral l/R injury by real-time quantitative PCR.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with I/R group.

2.3 Rus對腦l/R損傷小鼠Per1，Clock和Bmal1蛋白水平的影響

如圖3所示，與假手術(shù)組相比，I/R組Per1，Clock和Bmal1蛋白表達水平下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；與I/R組相比，I/R+Rus組上述3種蛋白表達水平均上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.3 Effect of Rus on protein expressions of Per1，Clock and Bmal1 in mice with cerebral l/R injury by Western blotting.See Fig.1 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative reslut of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with I/R group.

3 討論

在哺乳動物中，生物鐘調(diào)節(jié)著生物的生化和行為過程，維持其生理和行為的晝夜節(jié)律性［13］。研究表明，晝夜節(jié)律紊亂會導致生物體生理和生物行為改變，進而影響到疾病的發(fā)生和發(fā)展［14-15］，有研究證實，時鐘基因Per1被敲除后，腦I/R損傷更為嚴重［16-17］。在I/R小鼠模型上，小鼠腦缺血損傷的程度會因缺血發(fā)生的時刻不同而變化，在授時因子時間0（zeitgeber time 0，ZT0）發(fā)生的腦缺血損傷最嚴重，在ZT18發(fā)生的缺血損傷最輕［5］。其他研究證實，大鼠在ZT14發(fā)生的腦缺血損傷最嚴重，且海馬中缺血損傷標志物胱天蛋白酶3，8和9的水平最高［18］。表明不同動物不同區(qū)域腦缺血損傷最嚴重的時刻有差異。缺血性損傷的程度具有晝夜節(jié)律，提示時鐘基因的表達與腦I/R損傷有一定的相關(guān)性?；诖耍茰y通過藥物調(diào)控時鐘基因的表達，可能發(fā)揮減輕腦I/R損傷的作用。

本課題組前期研究表明，ig給予Rus可有效減小I/R損傷小鼠的腦梗死體積、減輕腦水腫和降低神經(jīng)功能評分，且10 mg·kg-1劑量顯示較好藥效［9-10］。本研究的結(jié)果顯示，與假手術(shù)組小鼠相比，I/R小鼠皮質(zhì)組織中Per1，Clock和Bmal1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平均下調(diào)。相對于I/R組，I/R+Rus組時鐘基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達升高，提示Rus可能通過上調(diào)時鐘基因的表達以減輕小鼠腦I/R損傷。此外有研究表明，褪黑激素和Bmal1增加了小鼠腦神經(jīng)瘤細胞糖氧剝奪后的細胞存活率，這與絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白存活途徑的表達增加有關(guān)［19］。并且證明了褪黑激素在細胞生理條件下和糖氧剝奪之后，可通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號通路調(diào)節(jié)Bmal1蛋白的表達。本研究表明，ig給予Rus可上調(diào)小鼠腦皮質(zhì)時鐘基因表達，推測Rus可能通過相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)時鐘基因的表達，從而減輕腦I/R損傷，相關(guān)機制仍需進一步研究。

綜上所述，Rus可能通過上調(diào)時鐘基因Per1,Clock和Bmal1 mRNA和蛋白表達改善小鼠腦I/R損傷，但其具體機制尚不清楚。深入研究Rus調(diào)節(jié)時鐘基因減輕腦I/R損傷的機制，對腦I/R損傷的防治具有重要的意義。