駱駝蓬內(nèi)生細菌多樣性與抗菌活性研究

張耀星，朱玉芳，柳耀年，石娜娜，張淼森，夏占峰

（塔里木大學生命科學學院/塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

駱駝蓬為蒺藜科多年生草本植物，具有止咳平喘，祛風濕，消腫毒等功效，并具有較好的抗腫瘤活性，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)具有保護作用，還具有單胺氧化酶的抑制作用、抗菌作用、輻射防護作用和抗包蟲作用等[1]。駱駝蓬植株及其種子富含多種生理活性物質，其中主要有效成分是駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿等生物堿[2]。美國西奈山伊坎醫(yī)學院COHEN J等[3]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)物中添加去氫駱駝蓬堿可驅動產(chǎn)生胰島素的人類β細胞進行持續(xù)分裂和增殖，駱駝蓬堿處理可使β細胞的數(shù)量增至三倍，在模擬人類糖尿病的三組轉基因小鼠中能夠更好的控制血糖。最新研究表明，駱駝蓬堿還具有一定的殺蟲活性，近年來藥用植物內(nèi)生菌也是較為火熱的研究對象，內(nèi)生細菌幾乎存在于所有的植物中，它們與植物互利共生，在促進植物生長、提高抗逆性與產(chǎn)生活性化合物等方面起著重要作用[4]。駱駝蓬作為藥用植物，針對其藥用成分及活性研究較多，而但針對其內(nèi)生菌開展的研究鮮有報道。本研究通過SOB、TSB等多種培養(yǎng)基分離駱駝蓬內(nèi)生細菌，對分離獲得的駱駝蓬內(nèi)生細菌進行種類鑒定探索其物種多樣性。采用平板對峙法和孔碟法，以解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovory）為靶標進行抑菌活性篩選，獲得多個抑菌活性菌株，為駱駝蓬內(nèi)生菌資源的開發(fā)和利用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

2019年6月，從塔克拉瑪干沙漠西緣十二團場十連（81°30′10″E，40°45′02″N）采集駱駝蓬根、莖、果實，樣品采集后裝于自封袋中，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試靶標菌

Erwinia amylovory為革蘭氏陰性細菌，能引起蘋果、梨等果樹病害[5-7]。由塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨（g/L）：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，氯化鈉5.0，瓊脂粉18.0，pH 7.4～7.6。

SOB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母提取物5.0，氯化鈉0.5，氯化鉀 0.2，氯化鎂 0.1，瓊脂粉18.0，pH 7.4～7.6。

TSB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨17.0，大豆蛋白胨3.0，葡萄糖2.5，氯化鉀5.0，磷酸氫二鉀2.5，瓊脂粉18.0，pH 7.4～7.6。

YMA培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物1.0，甘露醇1.0，磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.2，氯化鈉0.1，碳酸鈣1.0，瓊脂粉18.0，pH 7.4～7.6。

MC培養(yǎng)基（g/L）：大豆蛋白胨5.0，牛肉膏粉5.0，酵母膏粉5.0，葡萄糖20.0，乳糖20.0，碳酸鈣10.0，中性紅0.05，瓊脂粉18.0，pH 6.0。

YEB培養(yǎng)基（g/L）：牛肉浸膏5.0，酵母浸膏1.0，蛋白胨5.0，蔗糖5.0，七水硫酸鎂0.5，瓊脂粉18.0，pH 6.9～7.1。

ISP2培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物4，葡萄糖4，麥芽糖10，硫酸鐵0.05，硫酸鋅0.05，氯化錳0.05，瓊脂粉18，pH 7.4～7.6。

高糖培養(yǎng)基（g/L）：牛肉浸膏8.0，蔗糖50.0，放線菌酮0.05，溴百里酚蘭0.05，中性紅0.0125，瓊脂粉18.0，pH 7.0。

1.4 樣品處理

表面消毒：駱駝蓬樣本用自來水洗凈，將植株的根、莖、果實分別處理，莖與根切成約1 cm長的小段，浸泡于75%酒精40 s，浸泡于1 g/L次氯酸鈉溶液8 min，再浸泡于75%酒精40 s，最后用無菌水沖洗5遍。保留最后一次沖洗的無菌水，涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，常溫培養(yǎng)，檢測表面消毒效果。

菌液制備：根、莖、果實樣本消毒完成后，在無菌環(huán)境下加入生理鹽水研磨，制成菌液備用，以10倍梯度稀釋，配制3個梯度。

1.5 駱駝蓬內(nèi)生菌的分離與保藏

吸取各梯度菌液0.5 mL涂布于不同分離培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基及梯度設置三個重復，32℃下倒置培養(yǎng)，3～5 d后挑取各種形態(tài)的菌落，采用三區(qū)劃線法純化，獲得純培養(yǎng)[8]。以甘油（30%）作為保護劑，保藏于-20℃。

1.6 駱駝蓬內(nèi)生細菌的種類鑒定

采用酶解法提取內(nèi)生菌的基因組DNA[9]，采用通用引物27F和 1492R進行PCR擴增16S rDNA[10]，電泳檢測[11]PCR產(chǎn)物。寄送PCR產(chǎn)物至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結果采用SeqMan軟件進行序列拼接，用EZbiocloud數(shù)據(jù)庫進行16S rDNA序列相似度比對[12]，判斷微生物的種類。

1.7 抑菌活性菌株的篩選

初篩采用平板對峙方法[13]對分離獲得的菌株以解淀粉歐文氏菌為靶標進行抑菌活性篩選。取待測菌菌餅放置在涂有靶標菌的高糖培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h。設置平行實驗3組，記錄抑菌圈產(chǎn)生情況。（抑菌圈半徑=待測菌菌餅邊緣至靶標菌菌苔邊緣）

復篩采用孔碟法。挑取初篩陽性菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，5 d后離心，分別收集上清液和菌體，上清液45℃烘干后用甲醇溶解獲得發(fā)酵液粗提物，菌體烘干后用甲醇溶解獲得菌體粗提物。將涂有靶標菌的高糖固體培養(yǎng)基打孔（直徑0.6 cm），注入發(fā)酵液粗提物和菌體粗提物，28℃培養(yǎng)48 h。設置平行實驗3組，記錄抑菌圈產(chǎn)生情況。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生菌在駱駝蓬中的分布

分離培養(yǎng)后依照菌落特征形態(tài)初步排除重復，最終分離到72株駱駝蓬內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細菌60株（見表1），內(nèi)生放線菌12株（見表2）。

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 駱駝蓬內(nèi)生放線菌

內(nèi)生菌在駱駝蓬植株的根、莖、果實中都有分布，其中莖內(nèi)所分離得到的菌株數(shù)量明顯高于根和果實。葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬菌株在根、莖、果實中均有分布，占內(nèi)生菌總數(shù)的11.8%；類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的菌株僅在根中分離得到，13個菌屬的菌株（如代爾夫特菌屬、微小桿菌屬、亮桿菌屬等）僅在莖中分離得到，占76.5%。

2.2 不同培養(yǎng)基分離駱駝蓬內(nèi)生菌效果

對于駱駝蓬內(nèi)生細菌，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和YMA培養(yǎng)基的分離效果最好。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離得到11株內(nèi)生菌，其中葡萄球菌屬4株，芽孢桿菌屬2株，假單胞菌屬（Pseudomonas）2株，內(nèi)生芽孢桿菌1株，短波單胞菌屬（Brevundimonas）1株，代爾夫特菌屬1株；YMA培養(yǎng)基分離得到9株內(nèi)生菌，其中芽孢桿菌屬8株，劉志恒菌屬（Zhihengliuella）1株。對于駱駝蓬內(nèi)生放線菌，培養(yǎng)基分離效果為：TSB培養(yǎng)基＞YMA培養(yǎng)基＞MC培養(yǎng)基＞察氏培養(yǎng)基=NA培養(yǎng)基，分離效果較好的TSB培養(yǎng)基分離得到4株內(nèi)生放線菌，為短狀桿菌屬（Brachybacterium）、鏈霉菌屬與微桿菌屬（Microbacterium）。

2.3 駱駝蓬內(nèi)生菌多樣性

將分離獲得72的株內(nèi)生菌提取基因組DNA，PCR擴增16S rDNA序列并測序，經(jīng)序列比對，并構建進化樹，顯示駱駝蓬內(nèi)生菌呈現(xiàn)較豐富的物種多樣性（見圖1）。駱駝蓬內(nèi)生菌共分布于7個目15個科17個屬共30種。其中細菌60株，分布在6個目10個科12個屬22種，這12個屬分別為葡萄球菌屬、類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、短波單胞菌屬、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、代爾夫特菌屬、微小桿菌屬、劉志恒菌屬、根瘤菌屬（Rhizobium）、農(nóng)桿菌屬、亮桿菌屬。分離得到放線菌12株，分布在3個目5個科5個屬8種，這5個屬分別為鏈霉菌屬(Streptomyces)、短狀桿菌屬、土地芽孢桿菌屬（Terribacillus）、纖維菌屬（Cellulosimicrobium）、微桿菌屬。基于16S rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示芽孢桿菌屬為駱駝蓬內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌。

圖1 基于駱駝蓬內(nèi)生菌16S rDNA基因序列構建的neighbour-joining進化樹

2.4 抑菌活性菌株篩選

以解淀粉歐文氏菌為靶標菌，對從駱駝蓬根、莖、果實中分離到的72株內(nèi)生菌進行了抑菌活性的初篩與復篩，發(fā)現(xiàn)9株內(nèi)生菌初篩對靶標菌具有抑制活性，陽性率為12.5%，分屬于芽孢桿菌屬（4株）、大洋芽孢桿菌屬（1株）、微小桿菌屬（1株）、鏈霉菌屬（1株）、農(nóng)桿菌屬（1株）、亮桿菌屬（1株）。復篩獲得10株對靶標具有抑制活性菌株，陽性率為13.3%，復篩中抑菌活性較強的有6株（抑菌直徑≥9 mm），其中芽孢桿菌屬、亮桿菌屬和鏈霉菌屬為主，（見表3）。Bacillussp.82004-1抑菌活性最強，抑菌圈直徑達到20 mm，（見圖2）。

表3 駱駝蓬內(nèi)生菌抑菌活性

圖2 菌株82004-1對解淀粉歐文氏菌抑菌活性

3 討論

本次研究共分離得到72株駱駝蓬內(nèi)生菌，基于16S rDNA序列進行種類鑒定，共在17個屬，其中芽孢桿菌為優(yōu)勢菌屬。芽孢桿菌屬是各種農(nóng)作物及果樹等經(jīng)濟作物中內(nèi)生菌常見的屬[14]，與本研究結果一致。沙漠環(huán)境中生長的駱駝蓬，其內(nèi)生細菌仍以芽孢桿菌為主，表明在極端環(huán)境下芽孢桿菌廣泛存在。因為芽孢桿菌在營養(yǎng)缺乏等不利條件下能夠形成抗逆性強的芽孢，有利于在沙漠極端環(huán)境生存。

對于駱駝蓬的研究大部分集中在內(nèi)生放線菌的分離，雷艷娟[15]分離得到的內(nèi)生放線菌主要來源為根部，本研究結果表明駱駝蓬的內(nèi)生菌主要集中于莖部，原因可能是本研究所分離得到的微生物主要為細菌，放線菌相對較少，而內(nèi)生細菌與放線菌的分布在駱駝蓬植株的根與莖中有所差別，表明內(nèi)生菌在植株各組織的分布存在特異性。推測其原因，可能與不同種類內(nèi)生菌進入植物的方式相關，或與植物各組織為微生物生長提供的營養(yǎng)等方面相關。

YMA培養(yǎng)基分離效果較好，分離的菌株主要為芽孢桿菌屬，可能與培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)成分和微生物長期所處的環(huán)境營養(yǎng)水平相關。由于駱駝蓬植株處于特殊的沙漠環(huán)境，處于駱駝蓬植株內(nèi)的芽孢桿菌屬從駱駝蓬內(nèi)所獲取的營養(yǎng)成分有限，而YMA培養(yǎng)基相對于其它培養(yǎng)基營養(yǎng)物質含量較少，因此在駱駝蓬內(nèi)的芽孢桿菌屬內(nèi)生菌更適合在YMA培養(yǎng)基所提供的低營養(yǎng)環(huán)境下生長。因YMA培養(yǎng)基中含有甘露醇，該物質適合較為復雜的細菌培養(yǎng)[16]，所以從YMA培養(yǎng)基上也分離得到一株劉志恒菌屬內(nèi)生菌。

研究表明解淀粉歐文氏菌生長繁殖速度快，常用的農(nóng)用抗生素對其引起的病害防治效果有限[17]。本研究篩選獲得的抑菌活性菌株主要分布在芽孢桿菌屬，芽孢桿菌是一類能抵抗不良環(huán)境，且大多數(shù)可產(chǎn)生活性次生代謝產(chǎn)物的菌屬[18-20]。有研究表明芽孢桿菌能產(chǎn)生多種蛋白類和脂肽類抗菌活性物質，具有較好的抑菌活性[21-23]。牛世全等[24]人在對多種細菌進行抑菌活性檢測時，篩選獲得一株抑菌活性強、抗菌譜廣的芽孢桿菌B.subtilis 7-2-3-4，對輪枝鐮刀菌、尖孢鐮刀菌等8種植物病原菌的抑菌活性均在63.5%以上。本研究篩選獲得一株強抑菌活性的類芽孢桿菌82004-1，可進一步探索其活性代謝產(chǎn)物，結合其培養(yǎng)周期短，代謝產(chǎn)物穩(wěn)定等性質，可嘗試規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)，開發(fā)生防菌劑，應用于果樹枝枯病的防治。

4 結論

從塔克拉瑪干沙漠西緣駱駝蓬中共獲得72株細菌，分布于7個目，15個科、17個屬，展現(xiàn)出豐富的多樣性，其中優(yōu)勢菌為芽孢桿菌屬。駱駝蓬內(nèi)生細菌主要分布于莖中，低營養(yǎng)的YMA培養(yǎng)基適用于駱駝蓬芽孢桿菌屬內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基適用于多種駱駝蓬內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)，在駱駝蓬內(nèi)生細菌中芽孢桿菌屬對解淀粉歐文氏菌的抑制性較強。

近年來研究人員對于藥用植物內(nèi)生菌的研究逐漸深入，藥用植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不僅可以提高宿主植物對于病害的抵抗力，也可以合成抗蟲、抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性物質。但是在極端環(huán)境下的內(nèi)生菌及其活性研究較少，駱駝蓬生活于塔里木盆地塔克拉瑪干沙漠，極端干旱且營養(yǎng)物質稀少，并且具有一定的藥用價值，因此，駱駝蓬及其內(nèi)生菌值得進一步深入研究。