嚙齒動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

方振宇，任 娟，全炳榮，金花子

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000）

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是指機(jī)體為了維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制細(xì)胞發(fā)生自主且有序的死亡過(guò)程[1]。與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡是機(jī)體為了更好地適應(yīng)新的生存環(huán)境所進(jìn)行的死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡主要的形態(tài)變化為細(xì)胞濃縮，染色體DNA 被以核小體為單位切成梯狀片段，細(xì)胞縮小，形成細(xì)胞凋亡小體，凋亡小體再通過(guò)細(xì)胞膜表面以出芽的方式脫落，最終被附近的吞噬細(xì)胞所吞噬[2]。

卵巢作為雌性動(dòng)物重要的生殖腺，其主要功能是生產(chǎn)卵細(xì)胞以及分泌雌激素。在雌性動(dòng)物的生殖周期中，99%以上的卵泡都會(huì)發(fā)生卵泡閉鎖從而退化，而僅有不到1%的卵泡能夠發(fā)育至成熟[3]，絕大部分的卵泡會(huì)發(fā)生閉鎖，而卵泡閉鎖的實(shí)質(zhì)就是細(xì)胞凋亡[4-5]。本文綜述了細(xì)胞凋亡的過(guò)程與調(diào)控機(jī)制，并對(duì)影響嚙齒類(lèi)動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的因素進(jìn)行分析，為揭示細(xì)胞凋亡機(jī)制的理論奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而有助于畜牧業(yè)動(dòng)物快速擴(kuò)繁。

1 細(xì)胞凋亡的過(guò)程與調(diào)控機(jī)制

1885 年Flemming[6]研究卵巢卵泡細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種與細(xì)胞壞死不同的細(xì)胞死亡現(xiàn)象，并在1887 年將這種細(xì)胞死亡現(xiàn)象稱(chēng)為染色質(zhì)溶解死亡。1972 年澳大利亞生物學(xué)家Kerr 等[7]在電鏡下觀察到有別于細(xì)胞膨脹、崩潰等細(xì)胞壞死的典型性狀，而是以細(xì)胞核濃縮、細(xì)胞內(nèi)DNA 斷裂等現(xiàn)象為特征的細(xì)胞死亡，其推測(cè)這種細(xì)胞壞死的死亡機(jī)理肯定和普通的細(xì)胞壞死不同，有可能是機(jī)體自身基因控制的一種死亡，因此將這種死亡現(xiàn)象稱(chēng)為“細(xì)胞凋亡”。

細(xì)胞凋亡過(guò)程可分為4 個(gè)階段：凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活凋亡基因、執(zhí)行凋亡、清除凋亡細(xì)胞。其機(jī)理是凋亡誘導(dǎo)因素與細(xì)胞受體經(jīng)生化作用后形成死亡信號(hào)并激活凋亡相關(guān)基因，半胱氨酸蛋白酶（Caspase）進(jìn)行活化反應(yīng)并激活核內(nèi)部的核酸內(nèi)切酶及Caspase-3，降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，致使細(xì)胞死亡，最后凋亡的細(xì)胞由吞噬細(xì)胞分解[8]。造成細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因主要有Caspase家族、Bcl-2家族及腫瘤壞死因子受體超家族等，其中Bcl-2家族與生殖細(xì)胞凋亡最為密切。

迄今為止，被科學(xué)所證實(shí)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路共有4 種[9]：凋亡受體信號(hào)通路、線(xiàn)粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路、Caspase 非依賴(lài)的細(xì)胞凋亡途徑。

1）凋亡受體信號(hào)通路。凋亡受體是一類(lèi)跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子超家族的一員，常見(jiàn)的受體有Fas、TNFRI、DR3，其對(duì)應(yīng)的配體為FasL、TNF、Apo-3。細(xì)胞外的凋亡配體與細(xì)胞膜上的凋亡受體特異性結(jié)合，并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，Caspase-8、Caspase-10 等被細(xì)胞內(nèi)的天冬氨酸特異性刺激后產(chǎn)生一系列的生化反應(yīng)。死亡受體聚合之后，導(dǎo)致接頭蛋白的結(jié)合并激活Caspase 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

2）線(xiàn)粒體通路。線(xiàn)粒體不僅是細(xì)胞能量的代謝中心，還是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中心，所以也將線(xiàn)粒體通路稱(chēng)為內(nèi)源性凋亡。線(xiàn)粒體在細(xì)胞功能強(qiáng)的區(qū)域廣泛分布。線(xiàn)粒體造成的細(xì)胞凋亡包括3 種機(jī)制：①電子傳遞、ATP 產(chǎn)生的破壞及氧化磷酸化；②激活并釋放Caspase 家族蛋白；③最為直接的方法是改變細(xì)胞氧化還原的能力。在凋亡因素刺激下線(xiàn)粒體跨膜電位消失，導(dǎo)致膜的通透性發(fā)生變化，細(xì)胞色素C（Cyt-c）釋放并與dATP、活化因子-1（Apaf-1）、pro-Caspase-9 結(jié)合形成凋亡小體，激活Caspase-9，最終造成細(xì)胞凋亡[10]。研究證明[11]雖然細(xì)胞的凋亡途徑有多種，但外源性（凋亡受體）途徑和內(nèi)源性（線(xiàn)粒體）途徑是主要的凋亡過(guò)程，且均由Caspase 家族介導(dǎo)。

3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的發(fā)現(xiàn)要比前面兩者稍晚一些，它和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系主要在于：①對(duì)鈣離子的作用；②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)；③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Bcl-2基因家族參與細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是Ca2+的主要儲(chǔ)存庫(kù)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+平衡破壞或者過(guò)度積累造成位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的Caspase-12 的表達(dá)，進(jìn)而激活Caspase-9，自噬相關(guān)蛋白被切斷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（圖1）。

圖1 細(xì)胞凋亡通路圖[13]

4）Caspase 非依賴(lài)的細(xì)胞凋亡途徑。通常情況下，凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）存在于線(xiàn)粒體內(nèi)膜，受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，AIF從線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，然后進(jìn)入細(xì)胞核中，引起核內(nèi)DNA 的聚集，并最終導(dǎo)致大量DNA片段的斷裂，造成細(xì)胞凋亡[12]。

2 影響嚙齒動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的因素

卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的主要原因是卵泡閉鎖。嚙齒動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制十分復(fù)雜，造成的原因也很多，主要分為內(nèi)在因素和外在因素。

2.1 內(nèi)在因素 激素、細(xì)胞因子等內(nèi)在因素是影響卵泡顆粒細(xì)胞凋亡最主要的因素，通過(guò)促進(jìn)或抑制凋亡因子對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。

2.1.1 激素 激素以對(duì)細(xì)胞特有的方式在其存在或消失的狀態(tài)下引起細(xì)胞凋亡，并通過(guò)對(duì)細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)的程度進(jìn)行調(diào)節(jié)，以維持機(jī)體平衡[14]。大部分激素對(duì)顆粒細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抑制作用。體內(nèi)研究表明，小鼠中促卵泡激素（FSH）表達(dá)可以在mRNA 水平上抑制3-硝基丙酸（3-NP）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和P53 上調(diào)的凋亡調(diào)控因子（PUMA）的表達(dá)；在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH 可以在mRNA 水平上抑制過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和PUMA的表達(dá)，證明FSH 能夠抑制顆粒細(xì)胞的凋亡[15]。這與牛生長(zhǎng)激素在小鼠卵巢細(xì)胞當(dāng)中過(guò)表達(dá)的結(jié)果相似[16]，相比于正常小鼠其卵泡凋亡率顯著降低16%，而排卵前的健康卵泡也比正常小鼠顯著高3.1%，表明牛生長(zhǎng)激素能夠減少卵泡的閉鎖率，進(jìn)而增加排卵數(shù)。但并不是所有的激素對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡具有抑制作用，Danilovich 等[17]對(duì)腦切除并經(jīng)過(guò)雌激素處理的大鼠進(jìn)行GnRH 類(lèi)似物（Leuprolide Acetate，LA）注射，之后通過(guò)原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)對(duì)表現(xiàn)出DNA 片段化的細(xì)胞核進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)定位，結(jié)果表明在所研究的所有時(shí)間（注射LA 的1、2、4 或7 d），經(jīng)過(guò)LA 處理過(guò)的小鼠其卵泡顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。總之，大部分激素通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。

2.1.2 細(xì)胞因子 細(xì)胞因子作為細(xì)胞外的環(huán)境因素影響卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，也可分成抑制凋亡和促進(jìn)凋亡兩類(lèi)[18]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-I（IGF-I）作為抑制細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子對(duì)卵泡影響較深，Chun 等[19]收集大鼠排卵前卵泡，進(jìn)行有無(wú)類(lèi)IGF-I 體外對(duì)照培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 后發(fā)現(xiàn)對(duì)照組凋亡DNA 片段增加，而IGF-1 組能夠自發(fā)地抑制顆粒細(xì)胞的凋亡作用。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）在卵泡中發(fā)揮的作用與IGF-I 有所不同，體外實(shí)驗(yàn)證明，TGF-α和TGF-β1只存在其中1 種因子時(shí)對(duì)顆粒細(xì)胞沒(méi)有影響，但它們同時(shí)存在的情況下，會(huì)協(xié)同導(dǎo)致大鼠顆粒細(xì)胞的凋亡[20]。此外，還有其他細(xì)胞因子對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡起著促進(jìn)作用，如溫鑫等[21]發(fā)現(xiàn)Zhangfei 因子在小鼠卵泡發(fā)育及閉鎖過(guò)程中均有表達(dá)而且參與調(diào)控卵泡的發(fā)育及閉鎖，證明Zhangfei 不僅能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激，還能夠抑制ERK1/2 的磷酸化，促進(jìn)卵巢細(xì)胞的凋亡。Choi 等[22]研究表明Krüppel 樣因子4（Klf4）過(guò)表達(dá)會(huì)通過(guò)下調(diào)Bcl-2 基因的水平增加排卵前大鼠顆粒細(xì)胞的敏感性，從而使顆粒細(xì)胞凋亡的比例升高。

凋亡是一種通過(guò)細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因和抗凋亡基因的共同調(diào)控，激活凋亡基因，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。例如Bcl-2家族基因，與細(xì)胞凋亡最密切相關(guān)的基因之一，在凋亡中起著重要作用。屈麗華[23]通過(guò)對(duì)大鼠不同發(fā)育時(shí)期卵細(xì)胞生長(zhǎng)研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2/Bax基因?qū)ζ渎雅菁?xì)胞的發(fā)育和凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用，且卵泡閉鎖及卵泡中不同細(xì)胞的凋亡機(jī)制與調(diào)控方式隨卵巢不同發(fā)育時(shí)期、卵泡不同發(fā)育階段而異。而汝文文[24]也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡中Bcl-2/Bax基因的比例越大細(xì)胞就趨于存活，反之則更趨于凋亡。除Bcl-2基因家族外，Caspase 家族也在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。多囊卵巢綜合征（PCOS）的大鼠卵巢組織中Caspase-3 的mRNA 水平比正常大鼠高，是因在其發(fā)病過(guò)程中NF-κB 通過(guò)正向誘導(dǎo)Caspase-3 的表達(dá)，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡[25]。

2.2 外在因素 除內(nèi)在因素外，環(huán)境污染物、輻射等一些外在因素也影響嚙齒動(dòng)物卵巢功能障礙，最終損害生殖系統(tǒng)[26]。

2.2.1 環(huán)境污染物 環(huán)境中許多有害物質(zhì)會(huì)通過(guò)不同的凋亡途徑誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡。盛菲等[27]使用不同濃度的多環(huán)芳烴（PAHs）對(duì)小鼠卵巢進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示隨著濃度增加卵泡數(shù)量減少，隨后通過(guò)免疫組化法證明PAHs 可通過(guò)干預(yù)Caspase-3、Caspase-9 和Bcl-2/Bax基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)卵泡凋亡，進(jìn)而影響卵泡功能。Loretta 等[28]對(duì)大鼠進(jìn)行4-乙烯基環(huán)己烯二環(huán)氧化物（VCD）80 mg/kg·d 的腹腔注射，并在隨后的時(shí)間點(diǎn)評(píng)估動(dòng)物的生殖性能時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，VCD 組中的周期性被破壞，導(dǎo)致其誘導(dǎo)大鼠卵泡破壞與卵巢早衰。同樣，將小鼠卵巢暴露于全氟丁烷磺酸鹽（PFBS）（≥200 mg/kg·d）中，PFBS 通過(guò)降低甲狀腺激素水平致使卵泡顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞Akt-mTOR 信號(hào)下調(diào)，最終導(dǎo)致卵泡發(fā)育和卵巢激素生物合成障礙[29]。由此得出，環(huán)境中存在著一些有毒物質(zhì)影響卵泡顆粒細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

2.2.2 植物提取物 植物中的一些物質(zhì)含有毒素，會(huì)直接影響包括卵巢在內(nèi)的生殖系統(tǒng)，引起卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。郭毅煒等[30]將斷乳至成熟期間的大鼠持續(xù)暴露于不同濃度赤霉素（GA3）時(shí)，結(jié)果顯示在低、中、高劑量GA3 組的有腔卵泡數(shù)量與對(duì)照組相比有所下降，而閉鎖卵泡數(shù)量上升。這與用棉酚培養(yǎng)大鼠卵巢的結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)表明在卵泡發(fā)育的所有階段，用棉酚處理過(guò)的大鼠卵泡數(shù)量明顯少于正常卵巢卵泡數(shù)量，證明棉酚會(huì)促進(jìn)卵泡閉鎖[31]。趙煜等[32]對(duì)注射5 mg/kg 玉米赤霉烯酮（ZEA）的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Fas 及FasL 的動(dòng)態(tài)變化表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示出總的上升趨勢(shì)，推測(cè)ZEA 可能通過(guò)上調(diào)Fas/FasL 來(lái)促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。

2.2.3 有機(jī)化合物 除了有毒物質(zhì)，一些無(wú)毒性的有機(jī)化合物也會(huì)對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的正常生長(zhǎng)造成損傷，引起卵泡閉鎖。郝麗[33]使用不同劑量的乙醇對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇灌胃劑量的提升，大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡程度逐漸加深，濃度6%～7%乙醇可能是細(xì)胞凋亡的分界點(diǎn)，一旦超過(guò)這個(gè)分界點(diǎn)就會(huì)引起凋亡卵泡和黃體的比例顯著升高。鄰苯二甲酸單酯（MEHP）的暴露影響大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，通過(guò)上調(diào)Caspase-3、Caspase-7 蛋白水平并降低Bcl-2 蛋白水平，從而降低大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的存活率[34]。此外，雷公藤甲素一方面通過(guò)抑制AKT 等信號(hào)通路、上調(diào)凋亡相關(guān)因子Caspase-3促進(jìn)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，另一方面增加了大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬小體以及自噬溶酶體數(shù)量，進(jìn)而達(dá)到抑制卵泡發(fā)育的目的[35]。

由上述3 個(gè)外在因素可知，環(huán)境中存在的一些化學(xué)物質(zhì)通過(guò)各種凋亡通路或直接或間接的影響卵巢的生殖功能，最終誘導(dǎo)卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。

2.2.4 輻射 目前，環(huán)境中輻射對(duì)人類(lèi)的影響日益增加，因此對(duì)于它的研究也受到廣泛關(guān)注。Lee 等[36]使用鈷-60源，總劑量為7.2 Gy（戈瑞），劑量率為12.0 cGy/min的γ射線(xiàn)平均致死劑量（LD 50）對(duì)青春期前小鼠進(jìn)行全身照射，在照射前的第0 d 和照射后的第1、2 和3 天，收集卵巢并評(píng)估形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，γ射線(xiàn)誘導(dǎo)小鼠卵巢卵泡的凋亡和變性。通過(guò)對(duì)不同狀態(tài)下手機(jī)輻射對(duì)雌性小鼠生殖功能和應(yīng)激反應(yīng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，暴露于輻射下的小鼠發(fā)育和成熟卵泡以及黃體的數(shù)量明顯減少，垂體促性腺激素、性腺類(lèi)固醇的血清水平和類(lèi)固醇生成因子-1（SF-1）、類(lèi)固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）以及孕酮的表達(dá)水平明顯降低，手機(jī)輻射會(huì)誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，從而影響雌性小鼠的生殖能力[37]。尉春華等[38]將在s 波平均密度分別為20 mW/cm2的高功率微波輻照實(shí)驗(yàn)組大鼠10 min，40 mW/cm2輻照5 min、10 min 后發(fā)現(xiàn)，其卵巢內(nèi)部C-myc 蛋白和Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，而40 mW/cm2組升高更為明顯，推測(cè)出高功率微波輻射能夠促進(jìn)Bcl-2 蛋白以及C-myc 蛋白的活化和表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)卵泡細(xì)胞的凋亡。

2.2.5 排卵方式 除了環(huán)境因素之外，某些人為因素也可能對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)或凋亡造成影響。陳艷婷等[39]研究不同促排卵方案對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，GnRH-a 和GnRH-ant 排卵方案促進(jìn)小鼠顆粒細(xì)胞的凋亡，而PMSG 排卵方案相比空白組的凋亡蛋白表達(dá)有所下降，說(shuō)明PMSG 方案可以抑制小鼠顆粒細(xì)胞凋亡。因此，選擇合適的排卵方案能夠減少卵泡閉鎖數(shù)量，有助于顆粒細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。張芳[40]對(duì)大鼠卵巢卵泡進(jìn)行重復(fù)超排卵，結(jié)果顯示卵泡閉鎖的速度增加，并且隨著超排卵的次數(shù)增加閉鎖速度越快。之后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)重復(fù)超排卵通過(guò)降低卵巢凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)使卵泡閉鎖，并且這種效果隨著超排卵次數(shù)的增加其降低的作用越發(fā)明顯[38]，但由于凋亡基因Bax的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，因此尚不能證明重復(fù)超排卵導(dǎo)致的卵泡閉鎖是由Bcl-2/Bax所調(diào)節(jié)的。通過(guò)上述方式對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡進(jìn)行人為調(diào)控，是控制動(dòng)物生產(chǎn)繁殖性能最直接的手段之一。

3 總結(jié)與展望

綜上可知，嚙齒動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡除了受到體內(nèi)各種調(diào)節(jié)因子的影響外，環(huán)境中的某些物質(zhì)也可能是造成凋亡的原因。但歸其本質(zhì)是某些刺激對(duì)凋亡基因進(jìn)行激活和調(diào)控，使體內(nèi)促凋亡基因的表達(dá)量增加，進(jìn)而通過(guò)各種凋亡通路致使顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)正常的生理過(guò)程，對(duì)維持內(nèi)環(huán)境平衡具有重要作用。深入研究卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制，可以調(diào)控動(dòng)物的發(fā)情周期，增加排卵卵泡的數(shù)目，從而達(dá)到提高受精率及繁殖率的目的,甚至還有助于進(jìn)一步解析腫瘤以及癌癥的作用機(jī)制，為今后的治療打基礎(chǔ)。