山羊AMH和AMHR2基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

李昆諭，劉玉芳，陶 林，江炎庭，歐陽(yáng)依娜，儲(chǔ)明星*，洪瓊花*

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056001；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

山羊（Capra hircus）又稱夏羊，是人類最早馴化的家畜之一[1]。山羊?yàn)槿祟愄峁┤?、奶、皮、毛等主要生活資料，在人類農(nóng)業(yè)文明和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著重要作用。產(chǎn)羔數(shù)在繁殖性狀中的權(quán)重為74%～96%，影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的因素有很多，且山羊的產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)遺傳力較低（0.1 左右）、受多個(gè)基因控制的復(fù)雜的閾性狀，因此，傳統(tǒng)的育種手段在短時(shí)間內(nèi)難以快速改良[2-3]。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)日趨成熟，其具有準(zhǔn)確度高、可操作性強(qiáng)、可以縮短育種時(shí)間、節(jié)約育種成本等優(yōu)點(diǎn)，能快速、高效地對(duì)山羊產(chǎn)羔性狀進(jìn)行改良，并顯著提高該性狀選擇效率，加快育種進(jìn)程[4]?？姑缋帐霞に兀ˋnti-MüLlerian Hormone，AMH）又稱作繆勒氏管抑制激素（Mullerian-Inhibiting Hormone，MIH）。AMH 由母羊卵巢顆粒細(xì)胞分泌，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族成員之一，高度保守的AMH 蛋白是由2 個(gè)相同的70 kDa單體組成的140 kDa 二聚體糖蛋白，位于山羊的第7 號(hào)染色體上[5]。1953 年，法國(guó)科學(xué)家Jost 等[6]在兔子雄性胎兒支持細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了AMH基因，該基因在性別分化過程中可以促使中腎管發(fā)育成雄性生殖器官并使繆勒氏管退化。AMH 蛋白主要通過與其特異性結(jié)合受體AMHR2 結(jié)合后激活并磷酸化TGF-β-1R（ALK2，3，6），從而啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。此外，這2 種蛋白結(jié)合后還激活A(yù)MHR1，被激活的AMHR1 將下游Smad 蛋白磷酸化，隨后，磷酸化的Smads 與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而發(fā)揮功能，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。同時(shí)，該調(diào)控模式也是TGF-β家族基因的主要調(diào)控模式[8]。此外，BMP 家族成員也可影響顆粒細(xì)胞中AMH的表達(dá)，BMP15 蛋白可通過p38/MAPK 信號(hào)通路上調(diào)AMH的表達(dá)，且濃度越大上調(diào)影響也越大[9]。BMP4 和BMP6 可顯著提升牛顆粒細(xì)胞中AMHmRNA 的表達(dá)量[10]，體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞在單獨(dú)添加BMP2、BMP6、BMP15 時(shí)，可以顯著提高AMHmRNA 的表達(dá)量，BMP6、BMP15 也可顯著增加AMHR2基因的表達(dá)量[11]。BMP4 可以顯著提升綿羊顆粒細(xì)胞中AMHmRNA 的表達(dá)量[12]。AMH可作為評(píng)估卵巢儲(chǔ)備、預(yù)測(cè)卵巢年齡的優(yōu)良分子標(biāo)記[13-14]，在輔助生殖技術(shù)（ART）中，AMH可以用來預(yù)測(cè)山羊[15]、綿羊[16]的超排反應(yīng)，用來標(biāo)記超數(shù)排卵和體內(nèi)胚胎反應(yīng)，作為預(yù)測(cè)超數(shù)排卵中排卵反應(yīng)的重要指標(biāo)[17]。鄭竹清[18]、Lai 等[19]研究表明，AMH在高繁和低繁羊群體中有明顯的差異，AMHR2在高繁殖力組中被強(qiáng)烈選擇。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)云上黑山羊（云上黑山羊是以云嶺山羊?yàn)槟副?、努比山羊?yàn)楦副九嘤傻奈覈?guó)第一個(gè)肉用黑山羊品種[20-21]）的重測(cè)序結(jié)果，推測(cè)AMH基因和AMHR2基因可能對(duì)產(chǎn)羔數(shù)有一定影響，本研究旨在分析AMH和AMHR2基因在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊群體中的遺傳多態(tài)性及其與產(chǎn)羔性能的相關(guān)性，以期能夠?yàn)樯窖虻母叻敝沉?biāo)記輔助選擇育種提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 共采集768 只山羊（2～5 歲）的血液，其中云上黑山羊544 只、濟(jì)寧青山羊133 只、遼寧絨山羊91 只（表1）。本實(shí)驗(yàn)將濟(jì)寧青山羊視為高繁殖力群體，遼寧絨山羊視為低繁殖力群體[22-23]。所有實(shí)驗(yàn)用山羊飼養(yǎng)條件環(huán)境一致，云上黑山羊擁有至少1 胎產(chǎn)羔數(shù)記錄，部分擁有初生窩重和斷奶窩重（3 月齡）記錄，所有羊均采用頸靜脈采血（10 mL/只），使用EDTA-K2抗凝，-20℃保存。

表1 被測(cè)山羊品種及個(gè)體數(shù)量信息

1.2 血液DNA 的提取 實(shí)驗(yàn)山羊使用酚-氯仿法提取基因組DNA，采用Nano Drop 2000 檢測(cè)DNA 樣本濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量。

1.3 基因分型 采用Sequenom MassARRAY?SNP 分型技術(shù)對(duì)AMH基因g.89172108T＞G 位點(diǎn)，AMHR2基因g.26334739A＞G、g.26335365C＞T 位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，相關(guān)引物信息見表2，分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20 μL，DNA 濃度為40～80 ng/μL。

表2 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用Microsoft Excel 2020 軟件統(tǒng)計(jì)山羊AMH基因g.89172108T＞G，AMHR2基因g.26334739A＞G、g.26335365C＞T 位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)。采用IBM SPSS Statistics 19.0 軟件中的單因素方差分析。多重比較采用LSD 法。對(duì)山羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1AMH基因多態(tài)性分析 如圖1 所示，AMH基因g.89172108T＞G 位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊中均存在TT、TG 和GG 3 種基因型。

圖1 AMH 基因 g.89172108T＞G 位點(diǎn)分型結(jié)果

統(tǒng)計(jì)高繁（濟(jì)寧青山羊）和低繁（遼寧絨山羊）山羊品種中g(shù).89172108T＞G 位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率（表3），AMH基因g.89172108T＞G 位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到極顯著水平，且高繁群體的優(yōu)勢(shì)基因型為TG，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門；低繁群體的優(yōu)勢(shì)基因型為TT，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門。

群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，AMH基因g.89172108T＞G在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊中均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。卡方適應(yīng)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，AMH基因g.89172108T＞G 在濟(jì)寧青山羊中處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)（P＜0.05），在云上黑山羊和遼寧絨山羊中處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（P＞0.05）（表4）。

2.2AMHR2基因多態(tài)性分析 基因分型結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，AMHR2基因2 個(gè)候選位點(diǎn)均存在多態(tài)性。測(cè)序結(jié)果顯示，AMHR2基因g.26334739A＞G位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊中均存在AA、AG 和GG 3 種基因型，g.26335365C＞T 位點(diǎn)在高繁群體（濟(jì)寧青山羊）中存在CC、CT、TT 3 種基因型，但在低繁群體（遼寧絨山羊）中只存在CC 基因型（表4）。

圖2 AMHR2 基因g.26334739A＞G、g.26335365C＞T 位點(diǎn)分型結(jié)果

如表3 所示，AMHR2基因g.26334739A＞G 位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到顯著水平，但g.26335365C＞T 位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均不顯著。g.26334739A＞G 位點(diǎn)在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢(shì)基因型均為AA，優(yōu)勢(shì)等位基因均為A。g.26335365C＞T 位點(diǎn)在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢(shì)基因型均為CC，優(yōu)勢(shì)等位基因均為C。

表3 AMH、AMHR2 基因3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在高繁、低繁山羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

由表4 可知，AMHR2基因g.26334739A＞G 在3 種山羊中均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），AMHR2基因g.26335365C＞T 在3 種山羊中均為低度多態(tài)（PIC＜0.25）。卡方檢驗(yàn)表明，AMHR2基因g.26334739A＞G 在遼寧絨山羊、g.26335365C＞T 在濟(jì)寧青山羊中處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)（P＜0.05），其余位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.3 候選位點(diǎn)與云上黑山羊繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析 如表5 所示，所有基因候選位點(diǎn)均對(duì)產(chǎn)羔數(shù)無顯著影響，所有基因候選位點(diǎn)對(duì)初生窩重和斷奶窩重均無顯著影響。

表5 AMH 基因和AMHR2 基因?qū)υ粕虾谏窖虍a(chǎn)羔性能的影響（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）

3 討 論

3.1AMH基因與繁殖能力的關(guān)系 研究表明，AMH在原始卵泡、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡中的表達(dá)達(dá)到峰值并選擇優(yōu)勢(shì)卵泡，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡確定，AMH的表達(dá)量就會(huì)下降，在荷斯坦?fàn)倥?、緬因?安茹牛[12]、母馬[24-25]體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了這個(gè)現(xiàn)象，此外，AMH在閉鎖卵泡中不表達(dá)[26-27]。AMH主要通過自分泌或旁分泌作用于周邊細(xì)胞，主要表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞中，同時(shí)子宮內(nèi)膜異位癥腺體中也發(fā)現(xiàn)AMH有表達(dá)[28-29]。1999 年，Durlinger 等[30]發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型小鼠，AMH基因敲除小鼠的原始卵泡募集速度加快，說明AMH抑制了原始卵泡的募集。同時(shí)Durlinger 等[31]還發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠體內(nèi)FSH 水平較低，AMH降低了FSH 對(duì)卵泡發(fā)育的影響程度，此外在體外AMH也會(huì)抑制FSH 對(duì)腔前卵泡生長(zhǎng)的誘導(dǎo)作用。在生長(zhǎng)的卵泡中，顆粒細(xì)胞的FSH 敏感性在AMH的存在下降低[32]。綜上，AMH在卵巢中的主要作用為抑制原始卵泡募集以防止卵泡儲(chǔ)備的過早耗盡，調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的同時(shí)降低腔前和小腔卵泡對(duì)FSH 的敏感性以降低FSH 對(duì)卵泡發(fā)育的誘導(dǎo)作用[33-34]。此外，Seifer 等[35]發(fā)現(xiàn)AMH還具有抑制卵泡閉鎖的作用。Chang 等[36]和Grossman 等[37]發(fā)現(xiàn)AMH可以通過抑制cAMP 表達(dá)使芳香化酶的表達(dá)降低，從而抑制FSH 誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞雌激素的產(chǎn)生。因此，AMH基因與動(dòng)物的繁殖能力息息相關(guān)，或可作為檢驗(yàn)動(dòng)物繁殖能力的一個(gè)指標(biāo)。

3.2AMH和AMHR2基因多態(tài)性及其與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)、窩重之間的關(guān)系 目前，關(guān)于AMH和AMHR2與產(chǎn)羔數(shù)之間關(guān)系的報(bào)道較少，多集中于AMH對(duì)原始卵泡募集作用的影響及對(duì)FSH 的影響等。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMH基因g.89172108 T＞G 位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到極顯著水平，TT 基因型在高繁群體和低繁群體中頻率分布明顯不同，因此推測(cè)其突變可能對(duì)繁殖力產(chǎn)生了一定的影響，還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。群體遺傳學(xué)結(jié)果表明，AMH基因g.89172108T＞G 和AMHR2基因g.26334739A＞G 在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊、遼寧絨山羊中均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），表明這2 個(gè)位點(diǎn)在3 個(gè)群體中選擇潛力較大，3 個(gè)群體的遺傳多樣性較豐富，遺傳變異程度較大。AMHR2基因g.26335365C＞T 在3 種山羊中均為低度多態(tài)（PIC＜0.25），說明該位點(diǎn)在3 個(gè)群體中選擇潛力較小。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，AMH基因和AMHR2基因的所有候選位點(diǎn)對(duì)云上黑山羊的產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重、斷奶窩重均無顯著影響，表明這3 個(gè)位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)羔數(shù)及窩重可能都不是關(guān)鍵性位點(diǎn)。

4 結(jié) 論

AMH基因的突變位點(diǎn)g.89172108T＞G 和AMHR2的突變位點(diǎn)g.26334739A＞G、g.26334739A＞G 均不適合作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記，也不適合作為初生窩重和斷奶窩重的選擇標(biāo)記。