非班太爾對照品的定值研究

馬秋冉，張 璐，董玲玲，范 強，張秀英

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

非班太爾(Febantel)，又名苯硫胍，其化學名稱為[[2-(甲氧乙酰氨基)-4-(苯硫基)苯基]亞氨羰基]二氨基甲酸二甲酯，最先由德國拜耳制藥公司研制成功[1]，主要用于治療和控制動物的胃腸蛔蟲、絳蟲等蠕蟲[2-3]。非班太爾沒有單獨使用的劑型，通常將其與吡喹酮和噻嘧啶聯(lián)合使用制成復方非班太爾片，作為寵物驅(qū)蟲藥[4]。經(jīng)國家獸藥基礎信息查詢系統(tǒng)顯示，已有3個廠家獲批該制劑的新藥證書并生產(chǎn)銷售。在生產(chǎn)過程中，需使用非班太爾、吡喹酮和噻嘧啶對照品作為標尺，衡量產(chǎn)品質(zhì)量。目前，國內(nèi)已供應吡喹酮和噻嘧啶對照品，而非班太爾對照品只能依賴進口，其價格昂貴、購買周期長和供應不及時等問題，給國內(nèi)企業(yè)的研發(fā)與生產(chǎn)帶來不便。因此，為了更好地對該品種進行質(zhì)量控制，降低企業(yè)研發(fā)生產(chǎn)成本，研制首批非班太爾對照品。本文根據(jù)《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》[5]和《中華人民共和國獸藥典》2015年版[6]的要求，分別采用質(zhì)量平衡法和差示掃描量熱法(DSC法)2種方法對非班太爾對照品的含量進行定值研究。其中，質(zhì)量平衡法[7]也稱為雜質(zhì)扣除法，是通過測量其中所有雜質(zhì)的含量，從100%中減去雜質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，獲得主成分的質(zhì)量分數(shù)即含量的方法。本文以高效液相色譜法作為有機雜質(zhì)檢查方法，以卡爾費休氏滴定法作為水分檢查方法，以氣相色譜法作為可揮發(fā)性溶劑檢查法，以熾灼殘渣檢查法作為不可揮發(fā)性雜質(zhì)檢查法。DSC法基于熱動力學原理，通過度量非班太爾對照品中的總雜質(zhì)絕對含量來對其進行定值，該方法適用于加熱過程中不發(fā)生熱分解、不與外界產(chǎn)生熱效應的有機純物質(zhì)的定值測定[8]。2種方法的測定能夠更好地保證非班太爾對照品賦值的準確性。

1 儀器與試藥

儀器、試驗材料與試劑：Waters e2695 高效液相色譜儀(Empower 2 色譜工作站)，Waters 2998 二極管陣列檢測器(PDA)，Waters 2489 紫外檢測器(UV)，Mettler XS205 電子分析天平(精度0.01 mg)，Agilent 7698A 氣相色譜儀，Agilent 7697A頂空進樣器，瑞士萬通701KF水分測定儀，美國TA Q200 DSC儀，CWF11/5 馬弗爐。

非班太爾精制原料由陜西漢江藥業(yè)集團股份有限公司提供(批號為1533015)，非班太爾系統(tǒng)適用性對照品由EP提供(批號為1.1)，甲醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 非班太爾對照品制備 采用紅外分光光度法、紫外-可見分光光度法、元素分析法、X射線衍射法、核磁共振法、質(zhì)譜法對非班太爾精制原料進行結(jié)構(gòu)確認，測定結(jié)果與目標結(jié)構(gòu)一致。將非班太爾精制原料分裝成500份(每份約100 mg)，遮光密閉，在2～8 ℃ 保存。非班太爾結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 非班太爾結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Strucure of febantel

2.2 質(zhì)量平衡法定量

2.2.1 純度分析

2.2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸二氫鉀(取磷酸二氫鉀6.8 g，置1000 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度)-乙腈(60∶40)為流動相；檢測波長為280 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C的分離度應符合要求。

2.2.1.2 溶劑空白制備 混合溶液(乙腈∶四氫呋喃=1∶1)。

2.2.1.3 供試品溶液制備 取非班太爾對照品樣品10 mg，置10 mL量瓶中，用混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.4 系統(tǒng)適用性溶液制備 取非班太爾系統(tǒng)適用性對照品(含雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C)5 mg溶于1 mL混合溶液，搖勻，即得。

2.2.1.5 測定結(jié)果 按2.2.1.3項下配制方法，平衡制備6份供試品溶液。精密量取溶劑空白、系統(tǒng)適用性溶液和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。其中溶劑空白(圖2)對非班太爾測定無干擾；系統(tǒng)適用性色譜圖(圖3)中，雜質(zhì)A、B、C和非班太爾峰與相鄰色譜峰的分離度均符合要求；從供試品溶液色譜圖(圖4)可知，非班太爾對照品樣品中有關物質(zhì)包括雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和2個未知雜質(zhì)。按自身對照法以峰面積計算，非班太爾對照品樣品純度分別為：99.880%、99.907%、99.900%、99.903%、99.898%、99.901%，均值(n=6)為99.898%，標準偏差為0.009%。

圖2 溶劑空白色譜圖Fig 2 Liquid chromatogram of blank solution

圖3 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖Fig 3 Liquid chromatogram of system suitability solution

圖4 供試品溶液色譜圖Fig 4 Liquid chromatogram of test solution

2.2.2 水分 參照《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部附錄限量檢查法(水分測定法)，采用卡爾費休氏滴定法測定。實驗前，精密稱取標準水約20 mg，注入水分測定儀，標定滴定液，平行標定3次，3次連續(xù)標定結(jié)果的相對偏差小于1%。精密稱取非班太爾對照品樣品100 mg，迅速打開滴定池上玻璃塞將其置于反應瓶中，儀器觸控面板處輸入樣品稱樣量，滴定結(jié)束后系統(tǒng)自動顯示計算含水量。平行測定6份，結(jié)果為0.068%、0.063%、0.067%、0.081%、0.084%、0.074%，均值(n=6)為0.073%，標準偏差為0.008%。

2.2.3 熾灼殘渣 參照《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部附錄限量檢查法(熾灼殘渣檢查法)試驗。平行測定6份，結(jié)果為：0.064%、0.056%、0.050%、0.045%、0.059%、0.054%，均值(n=6)為0.055%，標準偏差為0.007%。

2.2.4 殘留溶劑 參照《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部附錄限量檢查法(殘留溶劑測定法)，采用頂空進樣方式。根據(jù)非班太爾精制原料合成路線可知，殘留溶劑為甲醇。

2.2.4.1 氣相色譜條件 以氰丙基苯基聚硅氧烷為固定液(DB624 Agilent毛細管色譜柱320 μm×1.8 μm，30 m)；起始溫度為50 ℃，保持5 min，然后以每分鐘15 ℃的速率升溫至180 ℃，保持3 min；進樣口溫度為200 ℃；氫火焰離子化檢測器(FID)溫度為230 ℃；氮氣為載氣，流速為1 mL/min，分流比20∶1；頂空進樣器平衡溫度80 ℃，平衡時間30分鐘，傳輸線溫度為120 ℃。

2.2.4.2 空白溶劑制備 取N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1 mL置20 mL頂空瓶中，立即用壓蓋器密封。

2.2.4.3 對照品溶液制備 取甲醇約30 mg置100 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL置20 mL頂空瓶中，立即用壓蓋器密封。

2.2.4.4 供試品溶液制備 取非班太爾對照品樣品約100 mg，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，加1 mL DMF溶劑溶解，立即用壓蓋器密封。

2.2.4.5 按2.2.4.4項下配制方法，平衡制備6份供試品溶液。按2.2.4.1項下色譜條件進行測定。結(jié)果為0.106%、0.106%、0.101%、0.100%、0.106%、0.104%，均值(n=6)為0.104%，標準偏差為0.003%。

2.2.5 質(zhì)量平衡法計算 選用格拉布斯(Grubbs)準則，對上述試驗數(shù)據(jù)是否存在可疑值進行判別，結(jié)果顯示無可疑值。以含量=純度×(1-水分含量-熾灼殘渣含量-殘留溶劑含量)×100%為公式，計算非班太爾對照品樣品含量(表1)。

表1 質(zhì)量平衡法定值結(jié)果Tab 1 The result of mass balance method(%)

2.3 差示掃描量熱法定值

2.3.1 測定條件 測量采用動態(tài)法，連續(xù)加熱使樣品熔融，獲得數(shù)據(jù)。升溫速率：1 ℃/min；升溫區(qū)間：110～140 ℃；爐內(nèi)氣體：氮氣。

2.3.2 樣品制備 平行稱取6份，分別置40 μL的標準AL2O3坩堝中，壓蓋。

2.3.3 測定結(jié)果 6份樣品的測定結(jié)果為99.61%、99.71%、99.63%、99.60%、99.65%、99.63%，均值(n=6)為99.64%，標準偏差為0.039%。差示掃描量熱曲線見圖5。

2.4 兩種方法含量定值結(jié)果等精度檢驗 采用科克倫法對兩種方法定值結(jié)果進行等精度判定?？瓶藗愑嬎愎剑?/p>

Si為每種方法單次測量的標準偏差；Smax為Si中最大值。判斷準則：當C≤C(α,m,n)時，表明組數(shù)據(jù)平均值間為等精度，反之判為不等精度。其中m為實驗測量組數(shù)，n為每組實驗檢測次數(shù)，α取0.05。C=0.0182/(0.0182+0.0392)=0.18，查科克倫檢驗臨界值表，得C(0.05,2,6)=0.8534。說明兩種方法互為等精度，因此取算術平均值作為最終定值結(jié)果，即非班太爾含量定值結(jié)果為99.7%。

2.5 均勻性檢驗 根據(jù)JJF 1006-1994《一級標準物質(zhì)技術規(guī)范》和JJF1343-2012《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》的技術要求，本研究從已分裝的500瓶非班太爾對照品中隨機抽取15個包裝單元進行均勻性檢驗，對隨機抽取的樣品從1到15編號，每個單元取3個子樣，按2.2.1項下方法進行均勻性檢驗，測量的數(shù)據(jù)采用單因素方法分析進行統(tǒng)計檢驗，非班太爾均勻性檢驗結(jié)果如表2所示。F

表2 均勻性檢驗結(jié)果Tab 2 The result of homogeneity test

2.6 穩(wěn)定性考察 為考察非班太爾對照品在長期儲存條件下以及外部環(huán)境變化條件影響下，特性量值保持不變的能力，本研究按照《標準物質(zhì)定值的通用原則與統(tǒng)計學原理》的有關要求，按2.2.1項下方法開展了長期和短期的穩(wěn)定性考察。長期穩(wěn)定性考察分別在第0、1、3、6、9、12個月進行考察；短期穩(wěn)定性考察，則將樣品分別置于高溫(60 ℃)、高濕(90% ± 5%，25 ℃)、光照(照度4500 Lx±500 Lx)條件下，分別于2、4、6、8、10 d進行考察。采用趨勢分析對穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果進行考察，若|b1|

表3 長期穩(wěn)定性與短期穩(wěn)定性統(tǒng)計Tab 3 The statistics of long-term and short-term stability test

2.7 不確定度評估 根據(jù)非班太爾對照品研制過程，詳細分析了每個環(huán)節(jié)引入的不確定度。不確定度主要由3部分組成，即均勻性引入的不確定度、穩(wěn)定性引入的不確定度(短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性)以及定值過程中引入的不確定度。

2.7.1 質(zhì)量平衡法定值不確定度

2.7.3 均勻性與穩(wěn)定性的不確定度 根據(jù)《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》中均勻性與穩(wěn)定性不確定評估的計算公式，計算均勻性不確定度(uss)為0.0033%，穩(wěn)定性不確定(us)為0.0072%。

3 小結(jié)與討論

本文采用質(zhì)量平衡法和差示掃描量熱法聯(lián)合對非班太爾對照品進行定值，兩種方法測定含量的結(jié)果基本一致。經(jīng)上述兩種定值方法的測定，非班太爾對照品最終定值結(jié)果為99.7% ± 0.3%，k=2，P=0.95。

其中，質(zhì)量平衡法是一種具有較高準確度的方法，其能夠直接溯源到SI中質(zhì)量單位(kg)，世界衛(wèi)生組織及歐洲藥典均推薦使用該方法作為藥物標準物質(zhì)的定值方法[9]。但該方法也具有一定的局限性，如不同雜質(zhì)響應值的差異及色譜分離能力的限制，這些因素都將導致質(zhì)量平衡法測定結(jié)果與實際值偏離。本文采用《歐洲藥典》非班太爾有關物質(zhì)檢查方法的色譜條件作為純度分析方法，該方法能夠檢出非班太爾對照品的全部有機雜質(zhì)，保證了純度分析的準確性。DSC法是一種熱分析方法，能夠在程序控制溫度下，測量輸入到試樣與參比物的功率差與溫度之間的關系，主要用于材料的研發(fā)、性能檢測與質(zhì)量控制。近年來，科研工作者將該方法拓展用于化學藥品對照品的純度分析。劉毅[10]等采用該方法測定安替比林、異丙安替比林等化學藥品對照品純度。王路[11]等利用DSC法對熊果苷對照品進行定值研究，并制備出首批熊果苷對照品應用于化妝品行業(yè)的質(zhì)量控制。DSC方法的測定結(jié)果受稱樣量、升溫速率、氣體種類影響較大。應根據(jù)樣品熱效應大小調(diào)節(jié)樣品量，通常為1～3 mg之間；DSC用于純度分析時升溫速率應在0.5～1 ℃/min，較快的升溫速率雖能提高靈敏度，但分辨率會顯著下降，造成測定結(jié)果偏差；使用惰性氣體可避免產(chǎn)生氧化反應峰，同時又可減少試樣揮發(fā)對監(jiān)測器的腐蝕[12]。

本文首次對非班太爾對照品進行定值研究，其結(jié)果符合國家獸用對照品的相關要求，并已經(jīng)過獸藥標準物質(zhì)化學藥品專業(yè)委員會審批，可作為國家獸用標準品發(fā)放和使用。此次定值研究不僅填補了國內(nèi)非班太爾在定值研究方面的空白，而且為我國獸藥行業(yè)的發(fā)展，特別是寵物用藥的發(fā)展提供了支持，具有重大意義。