董海峰 湯 樺 楊俊免 張煜玲 李 彪*

(1.石家莊四藥有限公司藥物研究院，河北省大容量注射劑工程技術(shù)研究中心，注射給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，石家莊 050000；2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所，北京100013)

基因毒性雜質(zhì)是指能引起遺傳毒性的雜質(zhì)，包括致突變性雜質(zhì)和其他類型的無(wú)致突變性雜質(zhì)[1]。其研究起源于歐洲發(fā)生的維拉賽特(甲磺酸奈非那韋)事件，歐洲藥政管理部門(mén)要求所有相關(guān)的上市許可持有人對(duì)在他們的藥品中是否會(huì)出現(xiàn)這些雜質(zhì)開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。歐洲藥品評(píng)估局，人用藥品委員會(huì)(CHMP)推出《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》[2]，引入了可接受風(fēng)險(xiǎn)的攝入量，即毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)這個(gè)概念。根據(jù)此閾值，按照每日預(yù)期的攝入量去計(jì)算出該活性藥物中能夠接受的雜質(zhì)水平。苯磺酸左旋氨氯地平為二氫吡啶類長(zhǎng)效鈣離子拮抗劑，具有鈣通道阻滯劑的特性。其對(duì)于治理高血壓有效果顯著，持久性好，副作用低等特點(diǎn)[3-5]，作為處方藥廣泛用于治療高血壓病和心絞痛病。由于苯磺酸左旋氨氯地平原料中含有的苯磺酸可能會(huì)與原料中殘留的醇類發(fā)生反應(yīng)生成苯磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)[6]，而根據(jù)ICH M7[7]指導(dǎo)原則，需要對(duì)苯磺酸左旋氨氯地平中潛在的苯磺酸甲酯(Methyl Benzenesulfonate, MBS)、苯磺酸乙酯(Ethyl Benzenesulfonate, EBS)、苯磺酸異丙酯(Isopropyl Benzenesulfonate, IBS) 進(jìn)行研究控制。目前苯磺酸酯類物質(zhì)的檢測(cè)方法報(bào)道較少，已報(bào)道的檢測(cè)方法有HPLC-UV法[8-10]，LC/MS法[11]，SPME-GC/MS法[12]等。但以上方法存在基質(zhì)干擾，適用范圍受限，靈敏度不佳等不足之處。本實(shí)驗(yàn)以苯磺酸左旋氨氯地平片為例，建立藥物中苯磺酸酯類物質(zhì)衍生HS-GC/MS的檢測(cè)方法。該方法使用碘化鈉對(duì)苯磺酸酯類物質(zhì)進(jìn)行衍生生成碘代烷，衍生法與直接進(jìn)樣法相比較，靈敏度有較大的提高，檢測(cè)限值遠(yuǎn)低于限度要求，可靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)苯磺酸酯化合物；與萃取法相比，頂空法具有選擇性強(qiáng)，基質(zhì)干擾小等特點(diǎn)。該方法可以滿足藥物(苯磺酸左旋氨氯地平片)中3種苯磺酸酯類物質(zhì)的檢測(cè)監(jiān)控工作。

1 儀器與試藥

7890B-7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫公司)；TurboMatrix 40全自動(dòng)頂空儀(珀金埃爾默公司)；XS-205電子天平(d=0.01 mg/0.1 mg，梅特勒公司)；Milli-Q純水機(jī)(Merck millipore公司)。

苯磺酸甲酯(純度>98.0 %)采購(gòu)于TCI公司；苯磺酸乙酯(純度>98.0 %)采購(gòu)于TCI公司；苯磺酸異丙酯(純度>97.0 %)采購(gòu)于阿拉丁公司；甲磺酸丁酯(純度98.5 %)采購(gòu)于百靈威公司；碘化鈉(純度 99.0 %)采購(gòu)于百靈威公司；無(wú)水硫代硫酸鈉(純度99.0 %)采購(gòu)于阿法埃莎公司；乙腈(色譜級(jí))采購(gòu)于默克公司；甲苯(色譜級(jí))采購(gòu)于默克公司。

2 方法

2.1 溶液制備

稀釋劑：將適量的水和乙腈按照20∶80(體積比)配制成混合溶液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

衍生試劑：稱取60 g碘化鈉和30 mg無(wú)水硫代硫酸鈉，置于同一50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，即得?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

內(nèi)標(biāo)溶液：量取10μL甲磺酸丁酯，置于10 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度線，搖勻；另精密量取此液0.4 mL于2000 mL稀釋劑中，搖勻，即得?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

對(duì)照品母液：精密稱取苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸異丙酯對(duì)照品約10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲苯溶液溶解，并稀釋至刻度線，搖勻，即得。現(xiàn)配現(xiàn)用。

混合對(duì)照品貯備液：精密量取各對(duì)照品母液0.5 mL，置于100 mL容量瓶，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度線，搖勻，即得?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

混合對(duì)照品溶液：精確量取混合對(duì)照品貯備液0.5 mL，置于10 mL容量瓶，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，即得?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

定量限溶液：量取對(duì)照品母液適量分別置于100 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻；另取上述各溶液適量置于100 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，配制得到每毫升溶液中含苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯分別為3.57 ng、4.61 ng、6.13 ng。現(xiàn)配現(xiàn)用。

線性對(duì)照品溶液：分別量取混合對(duì)照品貯備液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL分別置于10 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度線，搖勻，即得?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

準(zhǔn)確性樣品制備：稱取25 mg供試品于20 mL頂空瓶中，分別添加3個(gè)濃度水平(1.00、4.00、6.00 mg·kg-1)的混合對(duì)照品溶液各3份，加0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，0.5 mL衍生溶液，立即加蓋密封，立即檢測(cè)。現(xiàn)配現(xiàn)用。

對(duì)照品溶液制備：準(zhǔn)確移取混合對(duì)照品溶液0.5 mL，置于20 mL頂空瓶中加入0.5 mL衍生溶液，立即加蓋密封，立即檢測(cè)。

供試品制備：取供試品于研缽中研磨，稱取粉末約25.00 mg，精密稱定，置于20 mL頂空瓶中，加0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，0.5 mL衍生溶液，立即加蓋密封，立即檢測(cè)。供試品為苯磺酸左旋氨氯地平片，由石家莊四藥有限公司提供。

2.2 分析條件

頂空條件：加熱爐溫度：60 ℃；平衡時(shí)間：30 min；取樣針溫度：80 ℃；傳輸線溫度：120 ℃；進(jìn)樣時(shí)間：0.02 min。

氣相色譜條件：色譜柱：VF-WAXms毛細(xì)管柱 (30 m×0.25 mm×1.0 μm)；載氣：He(純度99.999 %)；柱流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣(20∶1)；柱箱溫度：初始40 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1升至140 ℃，保持0 min；后運(yùn)行：230 ℃，保持8 min。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度：220 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；離子檢測(cè)方式：選擇離子掃描(SIM)模式；苯磺酸甲酯(BSM)、苯磺酸乙酯(BSE)、苯磺酸異丙酯(IMS)、甲磺酸正丁酯(BMS)，經(jīng)衍生后依次得到碘甲烷(Mel)、碘乙烷(Etl)、碘異丙烷(iPrl)、碘正丁烷(Bul)。4種分析化合物(BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl、BMS-Bul)的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 4種分析化合物質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了色譜柱(DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、DB-624(30 m×0.25 mm×1.4 μm)、VF-WAXms(30 m×0.25 mm×1.0 μm)、柱流速(0.5、0.8、1.0 mL·min-1)、進(jìn)樣時(shí)間(0.01、0.02、0.03 min)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，考察了4種分析化合物(BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl、BMS-Bul)的分離效果及響應(yīng)情況，確定最優(yōu)的色譜條件。圖1為空白溶液、苯磺酸左旋氨氯地平及混合對(duì)照品溶液的色譜圖。色譜柱對(duì)比發(fā)現(xiàn)， DB-5MS、 DB-624色譜柱的固定相極性較弱，對(duì)4種分析化合物保留性較差，VF-WAXms屬于極性氣相色譜柱對(duì)4種分析化合物具有較好的保留性和分離度。4種分析化合物隨著柱流速的增加，響應(yīng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加，在0.02min后呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)。綜合考慮，最優(yōu)的柱流速和進(jìn)樣時(shí)間分別為0.8 mL·min-1和0.02 min。在最優(yōu)的檢測(cè)條件下，苯磺酸左旋氨氯地平對(duì)4種分析化合物檢測(cè)無(wú)干擾且響應(yīng)較好。圖1為空白溶液、苯磺酸左旋氨氯地平及混合對(duì)照品溶液的色譜圖。

圖1 優(yōu)化的HS-GC/MS條件下樣品溶液色譜圖

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 靈敏度、定量范圍及線性方程

采用3倍信噪比對(duì)應(yīng)濃度為檢出限，10倍信噪比為定量限。苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸異丙酯的檢出限(LODs)及定量限(LOQs)見(jiàn)表2。配制6份定量溶液，并連續(xù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，各成分檢測(cè)限、定量限均能滿足檢測(cè)要求(限量要求：150 ng·mL-1)，并且該方法在定量限濃度具有較好的重復(fù)性。

表2 3種苯磺酸酯化合物的檢測(cè)限和定量限

表3 3種苯磺酸酯化合物定量限的重復(fù)性(n=6)

取線性對(duì)照品溶液和定量限溶液經(jīng)HS-GC/MS分析檢測(cè)，以對(duì)照品濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)，相對(duì)響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種苯磺酸酯化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，3種苯磺酸酯化合物線性關(guān)系良好，適合定量分析。

表4 3種苯磺酸酯化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

3.2.2 精密度和重復(fù)性

配制6份對(duì)照品溶液，連續(xù)檢測(cè)。計(jì)算各組分相對(duì)響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察日內(nèi)精密度(編號(hào)1-6)。選取與日內(nèi)精密度不同的檢測(cè)日期對(duì)混合對(duì)照品溶液重復(fù)以上檢測(cè)過(guò)程，計(jì)算各組分兩次檢測(cè)相對(duì)響應(yīng)值的RSD，考察日間精密度(編號(hào)：1-12)。結(jié)果見(jiàn)圖2，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差(n=6,12)。結(jié)果顯示，3種苯磺酸酯化合物日內(nèi)精密度(n=6)的RSD在1.06%～1.82%之間；日間精密度(n=12)的RSD在0.83%～2.73%之間。該方法精密度良好。

圖2 3種苯磺酸酯化合物的日內(nèi)精密度(n=6)和日間精密度(n=12)

配制6份供試品樣品，經(jīng)HS-GC/MS分析檢測(cè)，計(jì)算各組分相對(duì)響應(yīng)值的RSD，考察重復(fù)性。結(jié)果顯示，6份供試品樣品中均未檢出BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl。本方法檢測(cè)重復(fù)性良好。

3.2.3 準(zhǔn)確性

在苯磺酸左旋氨氯地平片中分別添加3個(gè)濃度水平(1.00、4.00、6.00 mg·kg-1)的混合對(duì)照品溶液各3份。計(jì)算3種苯磺酸酯化合物的加樣回收率，考察方法準(zhǔn)確度。結(jié)果見(jiàn)圖3，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。9份樣品BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl的平均回收率(RSD)分別為109.89%(1.83%)、106.13%(3.87%)、103.32%(1.62%)。結(jié)果顯示，該方法準(zhǔn)確度良好。

圖3 3種苯磺酸酯化合物的準(zhǔn)確度(n=9)

3.2.4 耐用性

通過(guò)微調(diào)色譜條件，考察各組分相對(duì)響應(yīng)值的變化。調(diào)整色譜條件：升溫速率12 ℃·min-1和8 ℃·min-1，柱流量0.85 mL·min-1和0.75 mL·min-1，起始溫度42 ℃和38 ℃，加熱爐溫62 ℃和58 ℃，保溫時(shí)間32 min和28 min。結(jié)果見(jiàn)圖4，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差(n=11)。共計(jì)11種不同檢測(cè)條件下，3種苯磺酸酯化合物的RSD在3.96%～6.59%之間。結(jié)果顯示，各組分之間分離效果良好，且對(duì)定量檢測(cè)無(wú)影響，該方法耐用性良好。

圖4 3種苯磺酸酯化合物的耐用性(n=11)

4 結(jié)論

建立的頂空-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法，以甲磺酸丁酯為內(nèi)標(biāo)，頂空瓶?jī)?nèi)衍生，檢測(cè)苯磺酸左旋氨氯地平中3種苯磺酸酯化合物。方法學(xué)研究證明，該方法靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，線性關(guān)系良好，同時(shí)具有良好的精密度和耐用性，適用于藥物中苯磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)，可作為其質(zhì)量監(jiān)控的依據(jù)。