樺褐孔菌與其固體發(fā)酵物對(duì)2型糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激損傷作用

王 歡，王麗瑩，劉俊澤，唐 敏，陳長寶，王淑敏

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春 130117）

近年來，隨著社會(huì)的發(fā)展、科學(xué)的進(jìn)步，人們對(duì)大型真菌的研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)許多大型真菌具有很好的藥用價(jià)值，長期以來蘑菇（大型真菌）作為功能性食品和藥品被人們廣泛應(yīng)用和認(rèn)可[1?4]，例如靈芝、桑黃、冬蟲夏草、黑木耳、香菇、灰樹花、茯苓等真菌，而樺褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát是最具發(fā)展前景的藥用真菌之一[5?6]。樺褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát，又名白樺茸、樹蘑菇、西伯利亞靈芝等，有“森林鉆石”的美譽(yù)，隸屬銹革孔菌科，褐臥孔菌屬。在外文文獻(xiàn)中，學(xué)名常以Inonotus obliquus、Fuscoporia oblique出現(xiàn)。俗名為Birch mushroom、Black Birch touchwood、茶卡（Чага）等[7?8]。主要分布于俄羅斯、中國、日本、北歐的波蘭和荷蘭等國家[9?13]，早在16世紀(jì)初期，世界上就開始有人食用樺褐孔菌來用于治療糖尿病、腫瘤、肝病、胃病等[14?17]，同時(shí)，還具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞抗炎、抗病毒等生物活性[18?21]，因此樺褐孔菌有著悠久的歷史應(yīng)用背景。近年來，我國對(duì)食藥用研究十分重視，樺褐孔菌的相關(guān)研究炙手可熱，但由于樺褐孔菌的生長環(huán)境和生長年限的限制，樺褐孔菌在自然環(huán)境下生長多年才能獲得較大菌核，野生資源十分珍貴，這使得樺褐孔菌藥理活性和藥效研究沒有得到更好的發(fā)展。

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是一類以持續(xù)高血糖和血脂異常為主要特征的代謝類疾病。文獻(xiàn)中廣泛的報(bào)道了炎癥反應(yīng)與糖尿病密切相關(guān)，TNFα是一種主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)IL-1、IL-6的合成[22]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可抑制胰島素信號(hào)以及胰島素調(diào)節(jié)下的葡萄糖的攝取，表明胰島素抵抗的發(fā)生可以由TNF-α介導(dǎo)產(chǎn)生[23]。戚琛曄等[24]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)與糖尿病存在密切相關(guān)，氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。超氧化物歧化酶SOD，是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能夠迅速清除線粒體呼吸鏈電子傳遞過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度可以用丙二醛（MDA）的含量高低表示，MDA含量的降低可能意味著機(jī)體對(duì)抗氧化損傷能力增強(qiáng)[25?26]。

因此，研究組利用固體發(fā)酵技術(shù)對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行了深入研究，并比較了樺褐孔菌（菌粉）、樺褐孔菌水提物、固體發(fā)酵物（菌粉）、固體發(fā)酵物水提物對(duì)高糖高脂飲食+STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠體重、血糖、口服糖耐量及機(jī)體炎癥和氧化應(yīng)激水平的影響。本研究不但緩解了樺褐孔菌野生資源匱乏的問題，同時(shí)，評(píng)價(jià)了固體發(fā)酵物是否具有代替野生樺褐孔菌的潛力，并且對(duì)比了經(jīng)過提取和直接灌胃菌粉的藥理作用差別，為進(jìn)一步研究其藥理作用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌 采自長白山，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為樺褐孔菌Inonotus obliquus（Pers.）Pilát），標(biāo)本現(xiàn)保存于長春中醫(yī)藥大學(xué)，固體發(fā)酵產(chǎn)物由吉林省菌物藥生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室提供；STZ 美國Sigma 公司；二甲雙胍 中美上海施貴寶制藥有限公司；TNF-α，IL-6，IL-1β，MDA，SOD酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒 上海源葉生物技術(shù)有限公司；110只雄性SD大鼠（180~220 g） 遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，合格證編號(hào)：NO.2110023000118343。

TYS-200高速多功能粉碎機(jī) 浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司；恒溫水浴鍋 常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠；AUY220分析天平 島津國際貿(mào)易上海有限公司；酶標(biāo)儀 Rayto RT-6000；TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；血糖儀三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取 以薏米:麥麩:樺樹汁=2:1:8為最佳發(fā)酵基質(zhì)，在30 ℃條件下對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行固體發(fā)酵，得到固體發(fā)酵產(chǎn)物。取樺褐孔菌2.0081 g，固體發(fā)酵產(chǎn)物2.0104 g，加8倍量的水浸泡30 min，煎提3次，每次30 min，合并3次水煎液，濃縮，水浴蒸干，得樺褐孔菌水提物0.2607 g，樺褐孔菌固體發(fā)酵產(chǎn)物水提物0.6112 g。即樺褐孔菌的出膏率為12.98%，樺褐孔菌固體發(fā)酵產(chǎn)物的出膏率為30.40%。

1.2.2 分組及給藥 SD大鼠隨機(jī)分為11組，每組10只：空白組（生理鹽水）；模型組；陽性藥組（二甲雙胍，0.2 g/kg）；樺褐孔菌水提物（WIO）組（0.4、0.8 g/kg）；樺褐孔菌菌粉（IO）組（3.08、6.16 g/kg）；固體發(fā)酵物水提物（WSFIO）組（0.4、0.8 g/kg）；固體發(fā)酵物（SFIO）組（1.3、2.6 g/kg）。

1.2.3 造模 SPF級(jí)大鼠，雄性，隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其他大鼠喂養(yǎng)高脂高糖飼料6周，6周后單次小劑量腹腔注射STZ（50 mg/kg）誘導(dǎo)2型糖尿病模型（1% STZ溶解在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mmol/L，pH4.4）中，在半小時(shí)內(nèi)注射完），空白組以同樣的方式腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，一周后，禁食但不禁水，尾靜脈取血，血糖試紙測定空腹血糖值FBG，其中FBG≥7.8 mmol者為Ⅱ型糖尿病模型成功[27?28]。

1.2.4 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT） 造模過程中每周記錄大鼠體重變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，禁食24 h但不禁水，尾靜脈取血后應(yīng)用血糖儀測定并記錄血糖值即空腹血糖值FBG，以獲得基線血糖水平。隨后，各組大鼠灌胃葡萄糖溶液（2 g/kg），灌胃后采用血糖儀分別在0、30、60、90、120 min測定并記錄血糖值[29]。

1.2.5 生化指標(biāo)檢測 給藥結(jié)束后，迅速收集血清，采用ELISA試劑盒測定大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、SOD和MDA的水平，評(píng)價(jià)樺褐孔菌及其固體發(fā)酵物對(duì)糖尿病大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用GraphPad Prism 8.0軟件統(tǒng)計(jì)和作圖。所有數(shù)據(jù)均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。通過單因素方差分析與Tukey多重比較檢驗(yàn)比較組間差異。P<0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌對(duì)糖尿病大鼠體重的影響

由表1可知，從第5周開始，SD大鼠開始出現(xiàn)“三多一少”表現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠體重顯著降低（P<0.001）。給藥后，與模型組比較，IO低高劑量組大鼠體重第5周開始顯著升高；WIO低劑量組第10周開始顯著升高（P<0.01）；WSFIO高劑量組第9周開始顯著升高（P<0.05），且優(yōu)于陽性藥組。研究表明，樺褐孔菌菌粉及其水提物和固體發(fā)酵水提物均能顯著增加糖尿病大鼠體重，緩解體重持續(xù)減輕問題。

表1 樺褐孔菌對(duì)糖尿病大鼠體重的影響（xˉ±s, g, n=10）Table 1 Effects of I. obliquus on body weight of the diabetic rats (xˉ±s, g, n=10)

2.2 對(duì)大鼠口服糖耐量的影響

由表2可知，葡萄糖灌胃后，血糖開始逐漸升高，30~60 min后開始下降，與空白組比較，模型組大鼠血糖顯著升高（P<0.001），與模型組比較，陽性藥組和樺褐孔菌各給藥組血糖值均有降低的趨勢，SFIO 1.3 g/kg和SFIO 2.6 g/kg在葡萄糖灌胃30 min后顯著降低（P<0.01；P<0.05），分別降低了29.1%和25.4%，張等[30]的研究表明，樺褐孔菌總多糖（400、800 mg/kg）給藥兩周后血糖分別降至18. 97和12.66 mmol/L，而本研究中的給藥組均可達(dá)到近似或更優(yōu)效果，提示樺褐孔菌固體發(fā)酵物能相對(duì)較好地改善大鼠口服糖耐量，效果優(yōu)于其他給藥組。

表2 樺褐孔菌對(duì)糖尿病大鼠口服糖耐量的影響（xˉ±s, mmol/L, n=10）Table 2 Effects of I. obliquus on oral glucose tolerance of the diabetic rats (xˉ±s, mmol/L, n=10)

2.3 樺褐孔菌對(duì)糖尿病大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的影響

由表3可知，給藥 8 周后，與空白組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子 IL-6的水平極顯著升高（P<0.01），與模型組相比，陽性藥組可顯著降低血清中IL-6的含量（P<0.05），樺褐孔菌各給藥組在不同程度上可降低血清中IL-6的水平，但無顯著性差異（P?0.05）。

表3 樺褐孔菌對(duì)糖尿病大鼠血清中IL-6，IL-1β，TNF-α水平的影響（xˉ±s，n=10）Table 3 Effects of I. obliquus on IL-6，IL-1β and TNF-α levels in serum of the diabetic rats (xˉ±s, n=10)

與空白組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子IL-1β的水平顯著升高（P<0.05），與模型組相比，陽性藥組、WIO 低高劑量組、WSFIO 低劑量組均可顯著降低血清中IL-1β的水平（P<0.05）。

與對(duì)照組比較，大鼠血清中炎癥因子TNF-α的水平極顯著升高（P<0.01），與模型組相比，陽性藥組、IO 低高劑量組、WIO低劑量組、SFIO 低高劑量組和WSFIO 高劑量組均可顯著降低血清中TNF-α的水平。

2.4 樺褐孔菌對(duì)糖尿病大鼠血清中SOD和MDA的影響

由表4可知，給藥 8 周后，與空白組比較，模型組大鼠血清中SOD的水平極顯著降低（P<0.001），與模型組相比，陽性藥組和樺褐孔菌各給藥組在不同程度上均可顯著提高血清中SOD的水平（P<0.05，P<0.001或P<0.001）。結(jié)果不難看出，水提后得到的提取物的SOD水平較直接菌粉給藥均有所降低。

與空白組比較，模型組大鼠血清中丙二醛MDA的水平顯著升高（P<0.001），與模型組相比，陽性藥組和樺褐孔菌各給藥組均可降低血清中MDA的水平（P<0.01或P<0.001）。提示樺褐孔菌固體發(fā)酵物具有較好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本研究研究了樺褐孔菌及其固體發(fā)酵物對(duì)2型糖尿病大鼠機(jī)體的保護(hù)作用，結(jié)果表明，樺褐孔菌子實(shí)體及其固體發(fā)酵產(chǎn)物可以降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，顯著上調(diào)SOD的含量、降低MDA的含量，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善糖尿病大鼠口服糖耐量，抑制糖尿病大鼠體重的減輕，揭示樺褐孔菌固體發(fā)酵物具有良好的抗炎及抗氧化活性。

直接以菌粉、固體發(fā)酵物或二者的水提物給藥對(duì)各個(gè)指標(biāo)的影響不一，水提與直接粉碎（菌粉）給藥結(jié)果有一定差異，對(duì)體重減輕的改善樺褐孔菌菌粉（IO）優(yōu)于其水提物（WIO），WSFIO高劑量組優(yōu)于SFIO組；固體發(fā)酵物SFIO組對(duì)口服糖耐量的調(diào)節(jié)優(yōu)于其他給藥組；WIO低、高劑量組和WSFIO高劑量組對(duì)IL-1β的降低作用優(yōu)于其他給藥組；IO低、高劑量組，WIO 低劑量組，SFIO低、高劑量組和WSFIO高劑量組對(duì)TNF-α的抑制作用優(yōu)于其他劑量組；各給藥組均可提高SOD的水平，其中IO、SFIO和WSFIO組效果基本相當(dāng)，且優(yōu)于WIO組；各給藥組均可抑制MDA的水平，其中IO、WIO和WSFIO組效果基本相當(dāng)，且優(yōu)于SFIO組。總體來說，固體發(fā)酵物具有代替野生樺褐孔菌改善2型糖尿病的炎癥及氧化應(yīng)激潛能，其發(fā)酵工藝也需要進(jìn)一步深入研究。