房 巖，孫 剛，邱澤奎，藍 藍，龍 彪，黃俊江

(1.三明學院 資源與化工學院 藥用植物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心 福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經(jīng)營利用重點實驗室，三明 365004；2.長春師范大學 生命科學學院，長春 130032；3.福建農林大學 生命科學學院，福州 350002)

生物醫(yī)用材料越來越多地用于人工器官、再生組織誘導、藥物送達釋放、外科修復、治療診斷等領域[1]，而優(yōu)良的血液相容性是生物醫(yī)用材料植入人體的基本要求。血液相容性是指生物材料表面對血栓形成的抑制能力和血液正常生理功能的保持能力，包括降低血小板黏附和激活、減小紅細胞溶血率、延長凝血時間等[2]。伴隨著組織工程學的深入研究，人們追求更加穩(wěn)定、性能更加優(yōu)異、免疫原性更低、更加耐生物老化、與人體環(huán)境更加一致的生物材料，將人工智能、納米技術、仿生原理、藥物控釋技術相結合，向智能化、生命化、多功能化的方向發(fā)展[3]。經(jīng)過數(shù)十億年的生命進化和協(xié)同演化，生命體形成具有特殊微納結構、化學成分、浸潤性、黏附性和光學特性的天然表面[4-5]。以生物體表為模板，設計不同表面結構的新型醫(yī)用材料，成為近年來國內外的研究熱點[6-7]。本文在前期工作的基礎上[8-10]，制備具有昆蟲翅微觀結構和良好血液相容性的高分子仿生膜，探討表面粗糙形貌與血液相容性之間的作用關系，為抗凝血特種功能性生物材料的選擇、優(yōu)化、控制及制備提供可參考的研究方法和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取中華稻蝗(Oxyachinensis)、棉蝗(Chondracrisrosearosea)和東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)等3種昆蟲翅為模板，使用聚乙烯醇(PVA，國藥集團化學試劑有限公司，中國)、PDMS(Dow Corning 184，美國)為基材。剪取洗凈干燥的翅和PDMS膜(3 mm×3 mm)備用。有機試劑均為分析純(AR)。

1.2 方法

1.2.1 仿生膜的制備

按質量比1∶10稱取PVA與蒸餾水，恒溫水浴(90 ℃)，至溶解，磁力攪拌2 h(90 ℃，1 500 r/min)，靜置至無氣泡。將蝗蟲翅粘于載玻片上，PVA水溶液均勻涂在翅表，室溫靜置24 h，得到具有翅反結構的PVA模板。將PDMS預聚物A與固化劑B按質量比1∶10混合攪拌，至無氣泡。涂抹于PVA模板，靜置20 min，干燥2 h(120 ℃)，得到具有翅結構的PDMS仿生膜。同步制作無翅結構的光滑PDMS膜作為對照(CK)。

1.2.2 血小板黏附性的測定

將PDMS對照膜和仿生膜分別置于生理鹽水中清洗3次，PBS緩沖液中浸泡2 h；取10 mL新鮮抗凝人血進行離心(1 500 r/min，10 min)，將仿生膜置于上層的富血小板血漿中進行恒溫孵化(37 ℃，2 h)。吸去富血小板血漿，用PBS緩沖液清洗3次，用2.5%戊二醛固定(室溫，2 h)，按一定濃度梯度乙醇/水溶液脫水(30%、50%、70%、90%和100%，30 min/次)。臨界點干燥，噴金處理，掃描電子顯微鏡(日立Su8010，日本)SEM下觀察血小板形態(tài)，計算其密度。

1.2.3 溶血率的測定

取4 mL新鮮抗凝人血用5 mL生理鹽水稀釋。仿生膜在10 mL生理鹽水中孵化(37 ℃恒溫水浴，30 min)。加入0.2 mL稀釋血液，混合后恒溫(37 ℃，60 min)孵化。吸取適量液體離心(1 500 r/min，5 min)。取上清液，用紫外可見分光光度計(北京普析TU-1800，中國)測定波長540 nm處的吸光度。陽性對照組用10 mL蒸餾水加入0.2 mL稀釋血液；陰性對照組用10 mL 0.9% NaCl溶液加入0.2 mL稀釋血液，測定方法、保存條件與PDMS仿生膜相同。按下式計算溶血率：

溶血率=(Dt-Dnc)/(Dpc-Dnc)×100%

(1)

式中Dt：樣品的吸光度值；Dpc：陽性對照組的吸光度值；Dnc：陰性對照組的吸光度值。

1.2.4 動態(tài)凝血時間的測定

抽取6 mL新鮮血液，在樣品表面滴0.05 mL后靜置，設置5個時間點(10、20、30、40和50 min)，把樣品移至燒杯并加入25 mL蒸餾水，均勻混合，用紫外可見分光光度計測定波長540 nm處的吸光度。

1.2.5 微觀結構的表征

用導電膠帶分別將蝗蟲翅和仿生膜固定于銅質圓柱形樣品臺，使用小型離子濺射儀(日立E-1045，日本)對樣品表面噴金處理(厚度約20 nm)，置于SEM下觀察和表征。

1.2.6 浸潤性的測定

使用光學接觸角測量儀(Data Physics OCA20，德國)分別測量蒸餾水、血液在蝗蟲翅及仿生膜表面的接觸角。液滴體積為3 μL，每個樣品測量5次，取平均值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

血樣樣本數(shù)量n=5，結果以均值±標準差表示。采用Origin 8.5.1軟件進行單樣本t檢驗、雙樣本t檢驗和差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 表面微觀結構

3種蝗蟲翅表面具有相似的微觀粗糙單元，均為乳突狀。PDMS仿生膜成功復制了翅表面的形貌結構(圖1)。

(a)中華稻蝗O. chinensis蝗蟲翅；(b)棉蝗C. rosea rosea蝗蟲翅；(c)東亞飛蝗L. migratoria manilensis蝗蟲翅；(d)中華稻蝗仿生膜；(e)棉蝗仿生膜；(f)東亞飛蝗仿生膜。圖1 蝗蟲翅及仿生膜表面微觀結構(SEM)Figure 1 The surface microstructure of locust wings and biomimetic films

采用常用的兩種指數(shù)評價表面粗糙度[11-12]：d/l和d/(d+l)，其中，d為乳突直徑，l為乳突間距。指數(shù)(東亞飛蝗<中華稻蝗<棉蝗)越小，表示表面粗糙度(東亞飛蝗>中華稻蝗>棉蝗)越大(表1)。微觀粗糙形貌構成了表面復合浸潤性和血液相容性的結構基礎。

表1 PDMS仿生膜與對照膜的微觀結構參數(shù)及復合浸潤性Table 1 Microstructural parameters and complex wettability of the biomimetic and smooth PDMS films

2.2 表面浸潤性

仿生膜表面具有復合浸潤性，符合Cassie接觸模式，水滴接觸角(θ水)為141.3°～147.6°，為超疏水表面；血液接觸角(θ血)為119.8°～126.3°，顯示出較強的疏血性(表1)。其中，東亞飛蝗翅仿生膜的疏水性和疏血性最強，接觸角分別高于對照41.2%和32.1%。在蝗蟲翅表面，除了微米級突起還具有納米級結構，該多級結構是仿生膜疏水性和疏血性增強的主要因素。隨著微米級乳突直徑與間距比值的減小，表面粗糙度增大，接觸角隨之增加，接觸角與該比值呈負相關變化趨勢。

2.3 血小板黏附

血小板黏附是評價生物醫(yī)用材料血液相容性的重要指標。對照組表面黏附了大量活化的血小板以及大塊的纖維狀物質，血小板數(shù)量較多且已完全被激活，發(fā)生形變、團聚、黏附和凝血現(xiàn)象[圖2(a)]。在以中華稻蝗、棉蝗和東亞飛蝗翅為模板的仿生膜表面，血小板黏附量分別為3.06×104、2.83×104和0.95×104個/cm2，明顯低于對照組(10.89×104個/cm2)，而且血小板的形狀基本得以保持。其中，中華稻蝗、棉蝗翅仿生膜表面的血小板部分出現(xiàn)不規(guī)則偽足和變形，但基本結構仍清晰可辨[圖2(b)和(c)]。東亞飛蝗翅仿生膜表面的血小板數(shù)量最低，僅為對照組的8.7%，同時形態(tài)保持完好，具有較好的抗凝血性[圖2(d)]。

(a)對照；(b)中華稻蝗；(c)棉蝗；(d)東亞飛蝗。圖2 PDMS膜表面的血小板黏附狀態(tài)Figure 2 The adhesion condition of platelet on the PDMS films

2.4 溶血率

溶血率表征材料對紅細胞造成破壞的程度，對醫(yī)用材料的篩選具有特殊意義[13]。陽性對照組的吸光度值(Dpc)為1.225 L/(g·cm)，陰性對照組的吸光度值(Dnc)為0.001 L/(g·cm)，將樣品的吸光度值(Dt)代入公式(1)計算溶血率，PDMS仿生膜表面溶血率均<5%，符合我國醫(yī)用高分子材料的溶血率標準，血液相容性能夠達到機體環(huán)境的要求，可認為材料本身對紅細胞沒有破壞作用[14]。將仿生膜、對照膜表面溶血率分別與5%的國家標準進行單樣本t檢驗，所得P值設為P1值，3種仿生膜P1值均小于0.05，表明溶血率顯著優(yōu)于國家醫(yī)用材料標準；將仿生膜表面溶血率分別與對照膜表面溶血率進行單樣本t檢驗，所得P值設為P2值，東亞飛蝗和中華稻蝗的P2值均小于0.05，表明這兩種仿生膜表面溶血率顯著優(yōu)于對照膜表面，對凝血反應和微血栓形成具有有效的抑制作用(表2)。

表2 PDMS膜表面吸光度、溶血率及P值Table 2 Absorbance,hemolysis rate and P values of the PDMS films

2.5 動態(tài)凝血時間

動態(tài)凝血時間可檢測內源性凝血因子的激活程度，進而判斷生物材料的抗凝血性能。對同一時間點，吸光度越大，表明溶液中血紅蛋白濃度越高，血液在材料表面凝固性越弱，凝血時間越長，材料的血液相容性越好。仿生膜的吸光度高于對照組，除棉蝗50 min時間節(jié)點外，與對照組吸光度之間均有顯著差異(雙樣本t檢驗，P<0.05)，顯示出更加優(yōu)異的血液相容性。在10～30 min內，對照組和仿生膜吸光度均快速下降，最高幅度達58%，說明前30 min內源性因子被激活的程度較高。在40、50 min兩個時間節(jié)點，中華稻蝗和棉蝗仿生膜吸光度仍下降較快，東亞飛蝗仿生膜吸光度雖亦呈向下趨勢，但相對平緩。在5個時間節(jié)點，東亞飛蝗與中華稻蝗、東亞飛蝗與棉蝗仿生膜吸光度之間均有顯著差異(P<0.05)，表明其抗凝血性和血液相容性均優(yōu)于中華稻蝗和棉蝗仿生膜(表3)。

表3 PDMS膜表面的動態(tài)凝血過程Table 3 Dynamic coagulation course of blood on the surface of PDMS films

3 討論與結論

良好的抗凝血生物材料不僅要具有出色的加工和物化性能，而且要具有優(yōu)異的血液相容性和組織相容性。生物醫(yī)用材料與血液的相互作用受到多種因素的影響，如表面形貌、化學組成、浸潤性、血液成分、血流動力學特征等[15]。材料表面微觀形貌對血細胞的位向、附著、增殖以及蛋白質的合成、分泌等具有重要影響，是血液相容性的決定因素之一。傳統(tǒng)理論認為，表面粗糙度越高的材料暴露在血液的面積越大，凝血的可能性也就越大。但根據(jù)非光滑耦合理論[16]，一定范圍內的粗糙度可優(yōu)化表面的復合浸潤性，增大仿生膜的水滴接觸角與血液接觸角，減少血液中各種成分與材料表面的接觸機會以及對細胞膜的損傷，達到抗溶血和抗凝血的效果[17]。

正常情況下的血液流動為層流狀態(tài)，從血管軸心到血管壁，血液流動方向一致，但遇到粗糙表面時，層流狀態(tài)可能被打亂，變?yōu)橥牧?。微納雙重結構減小了血細胞與材料表面的有效接觸面積，降低了血細胞被捕獲的概率，產生特殊的細胞效應性，有利于抑制血栓的形成[18]。血管內壁的納米溝槽一方面抑制了血小板的黏附，另一方面優(yōu)化了流體動力學，降低了血液流動的紊亂性和血小板激活的概率[19]。

以蝗蟲翅為模板制備了PDMS仿生膜，成功復制了翅表面的形貌結構，表現(xiàn)出較強的疏水性(水滴接觸角141.3°～147.6°)和疏血性(血液接觸角119.8°～126.3°)。微納多級結構是仿生膜疏水性和疏血性增強的主要因素。根據(jù)血小板黏附、溶血率、動態(tài)凝血時間等指標，仿生膜表面具有較好的血液相容性。對照膜表面黏附了大量活化的血小板以及大塊的纖維狀物質，血小板數(shù)量較多且已完全被激活，發(fā)生形變、團聚、黏附和凝血現(xiàn)象。而在以中華稻蝗、棉蝗和東亞飛蝗翅為模板的仿生膜表面，血小板黏附量明顯低于對照組，而且血小板的形狀基本得以保持。其中，東亞飛蝗翅仿生膜表面的血小板數(shù)量最低，僅為對照組的8.7%，同時形態(tài)完好，未被激活，具有較好的抗凝血性。仿生膜表面溶血率均<5%，符合我國醫(yī)用高分子材料的溶血率標準。與對照膜相比，仿生膜的動態(tài)凝血過程更加平緩，具有更長的動態(tài)凝血時間。在3種仿生膜中，東亞飛蝗的抗凝血性能和血液相容性均優(yōu)于中華稻蝗和棉蝗仿生膜，對凝血反應和微血栓形成具有顯著的抑制效應，這是由于東亞飛蝗翅具有更大的表面粗糙度和更高的疏水性、疏血性，不利于血細胞的黏附和鋪展。具有大比表面積和高孔隙率的微納米表面可以促進血細胞與微結構單元之間的相互作用，并且微納米效應阻止了細胞的機械損傷。這與其他學者的研究結果一致[20]。構建具有特殊浸潤性的功能材料已成為各國學者關注的重點領域，其中仿生材料是近年來功能材料研究的熱點課題[21]。不同尺寸參數(shù)的表面形貌和浸潤性是研究其血液相容性的基礎。揭示這些因素與血液相容性之間的作用關系，可為與人類健康密切相關的新型醫(yī)用工程材料的選擇、制備及控制提供有利依據(jù)。