薛興翠， 孫軍奎， 賀連棟

(青海紅十字醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，青海 西寧 810000)

急性心力衰竭是臨床常見(jiàn)的一種心血管疾病，其中感染性?xún)?nèi)毒素血癥是引發(fā)心力衰竭的重要原因之一，而感染性?xún)?nèi)毒素血癥與革蘭氏陰性菌有關(guān)，脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜上的重要致病因素，可誘導(dǎo)心肌組織損傷從而引發(fā)心力衰竭[1-2]。天然植物提取物可能通過(guò)調(diào)控微小RNA(miRNA)表達(dá)從而減輕LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)在心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)異常并可能作為治療的潛在靶點(diǎn)[3-4]。

知母為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，知母皂苷B-Ⅱ(Timosaponin B-Ⅱ，TB-Ⅱ)是其主要活性成分，對(duì)異丙腎上腺素誘發(fā)的大鼠心肌梗死的心臟發(fā)揮保護(hù)作用[5]，但該成分對(duì)LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未闡明。長(zhǎng)鏈非編碼RNAXLOC_032768(LncRNAXLOC_032768)在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)可減輕腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及抑制細(xì)胞凋亡[6]，但它在知母皂苷B-Ⅱ影響LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究采用LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激的影響及對(duì)XLOC_032768的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 知母皂苷B-Ⅱ購(gòu)自上海莼試生物技術(shù)有限公司(粉末狀，純度≥98%，溶于DMSO中，批號(hào)20171203)。大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司；LPS購(gòu)自北京寰宇集團(tuán)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；GSH-Px、SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；si-NC、si-XLOC_032768轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海嵐派生物科技有限公司；TNF-α、PGE2檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海仁捷生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期者接種于96孔板(1×104個(gè)/孔)上，分別加入含1 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[7]，作為模型組；分別加入10、50、100 μg/mL 知母皂苷B-Ⅱ與含1 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[8]，作為低劑量組、中劑量組、高劑量組；將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，將si-NC、si-XLOC_032768轉(zhuǎn)移至心肌細(xì)胞，加入100 μg/mL知母皂苷B-Ⅱ與1 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別作為高劑量+si-NC組、高劑量+si-XLOC_032768組。

1.2.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 分別取各組心肌細(xì)胞，加入預(yù)冷的PBS，4 ℃、3 000 r/min離心6 min，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 MDA水平及GSH-Px、SOD活性檢測(cè) 取各組心肌細(xì)胞，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA水平，再加入0.25%胰蛋白酶消化，反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性，5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)比色法檢測(cè)GSH-Px的活性，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 NO、TNF-α、PGE2水平檢測(cè) 取各組心肌細(xì)胞，反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，采用硝酸還原法檢測(cè)NO水平，ELISA法檢測(cè)TNF-α、PGE2水平，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.5 細(xì)胞中XLOC_032768表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法。取各組心肌細(xì)胞，通過(guò)Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，XLOC_032768正向引物5′-CAAGGATTCT ACAGTCCAACAATTTC-3′，反向引物5′-CGATA CAAGTAATTTATTTCTAATTG-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。RT-qPCR反應(yīng)體系為cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正、反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算XLOC_032768相對(duì)表達(dá)。

1.2.6 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，收集各組心肌細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每孔加樣40 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，在4 ℃下孵育24 h，在TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL化學(xué)發(fā)光劑，暗室內(nèi)曝光顯影，通過(guò)Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，模型組凋亡率及Bax、cleaved caspase-3表達(dá)升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，各劑量組凋亡率及Bax、cleaved caspase-3表達(dá)降低(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

圖1 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響(Ⅰ)

表1 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.2 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組比較，模型組MDA水平升高(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性降低(P<0.05)；與模型組比較，各劑量組MDA水平降低(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.3 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥因子的影響 與對(duì)照組比較，模型組NO、TNF-α、PGE2水平升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組NO、TNF-α、PGE2水平降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥因子水平的影響

2.4 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中XLOC_032768表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組XLOC_032768表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，各劑量組XLOC_032768表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中XLOC_032768表達(dá)的影響

2.5 干擾XLOC_032768表達(dá)與知母皂苷B-Ⅱ聯(lián)合作用對(duì)LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響 與高劑量+si-NC組比較，高劑量+si-XLOC_032768組凋亡率及Bax、cleaved caspase-3表達(dá)升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表5。

表5 干擾XLOC_032768表達(dá)與知母皂苷B-Ⅱ聯(lián)合作用對(duì)LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖2 知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響(Ⅱ)

2.6 干擾XLOC_032768表達(dá)與知母皂苷B-Ⅱ聯(lián)合作用對(duì)LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥因子的影響 與高劑量+si-NC組比較，高劑量+si-XLOC_032768組MDA、NO、TNF-α、PGE2水平升高(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性降低(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 干擾XLOC_032768表達(dá)與知母皂苷B-Ⅱ聯(lián)合作用對(duì)LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥因子水平的影響

3 討論

心肌細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激、炎癥等密切相關(guān)，而心肌細(xì)胞凋亡可引發(fā)各種心血管疾病，因而抑制心肌細(xì)胞凋亡成為心血管疾病治療的重要環(huán)節(jié)，既往研究顯示中草藥具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等作用，并可抑制心肌細(xì)胞凋亡從而抑制心血管疾病的發(fā)展[9-11]。但知母皂苷B-Ⅱ在心血管疾病治療中的作用機(jī)制尚未完全闡明。

知母皂苷B-Ⅱ可抑制氧-糖剝奪脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元瘤細(xì)胞凋亡從而對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[12]。知母皂苷屬于百合科植物，其是知母干燥根莖的主要成分，知母皂苷B是其主要活性成分，其具有抑制氧自由基生成及修復(fù)神經(jīng)元損傷等作用[13]。知母皂苷B-Ⅱ可用于缺血性腦卒中的防治，此外，其可通過(guò)上調(diào)IL-18基因表達(dá)從而抑制肺癌細(xì)胞增殖及遷移[14]。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞凋亡率升高，而不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后凋亡率明顯降低，且隨著藥物劑量的增加而明顯降低。研究表明細(xì)胞接受到凋亡信號(hào)時(shí)，Bcl-2的表達(dá)降低，Bax的表達(dá)升高可促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)(cleaved caspase-3)從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)升高，Bcl-2的表達(dá)降低，不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)降低，Bcl-2的表達(dá)升高，證實(shí)知母皂苷B-Ⅱ可抑制LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞氧化損傷可誘導(dǎo)心肌損傷，氧自由基可被抗氧化酶降解從而促使機(jī)體維持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，GSH-Px、SOD屬于抗氧化酶，其活性降低可促使細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，氧自由基生成過(guò)量可促使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化從而破壞細(xì)胞膜完整性，MDA屬于脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物[16]。本研究結(jié)果顯示LPS處理后心肌細(xì)胞中MDA水平升高，GSH-Px、SOD的活性降低，而不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后MDA水平降低，GSH-Px、SOD的活性升高，提示知母皂苷B-Ⅱ可抑制LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，且呈劑量依賴(lài)性。炎癥因子NO、TNF-α、PGE2水平升高可加重心肌細(xì)胞炎癥損傷[17]。本研究結(jié)果顯示LPS處理后心肌細(xì)胞中NO、TNF-α、PGE2水平升高，而不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后NO、TNF-α、PGE2水平明顯降低，提示知母皂苷B-Ⅱ可抑制LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且呈劑量依賴(lài)性。

XLOC_032768表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)炎癥因子的分泌從而加重急性腎損傷[18]。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中XLOC_032768的表達(dá)下調(diào)，而不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后XLOC_032768的表達(dá)升高，且隨著劑量的增加而升高，提示知母皂苷B-Ⅱ可能通過(guò)上調(diào)XLOC_032768的表達(dá)從而減輕LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。為驗(yàn)證知母皂苷B-Ⅱ是否可通過(guò)調(diào)控XLOC_032768的表達(dá)從而發(fā)揮作用。本研究將si-XLOC_032768與知母皂苷B-Ⅱ共同處理LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示凋亡率升高，Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，MDA、NO、TNF-α、PGE2水平升高，GSH-Px、SOD的活性降低，提示干擾XLOC_032768表達(dá)可降低知母皂苷B-Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激的抑制作用。

綜上所述，知母皂苷B-Ⅱ可抑制LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與上調(diào)XLOC_032768的表達(dá)有關(guān)，XLOC_032768可能作為心血管疾病治療的潛在靶點(diǎn)，還可為進(jìn)一步揭示知母皂苷B-Ⅱ抗心血管疾病的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。