白楸化學(xué)成分及其體外抗HBV活性

曾 瑜， 王 凱， 馬健雄， 陳 路*

(1.柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州 545005；2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023；3.廣西金海堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，廣西 南寧 530313)

白楸Mallotuspaniculatus(Lam.) Muell. Arg. 為大戟科野桐屬植物，又名白匏子、白背桐等，主要分布于廣西、海南、廣東等地[1]，具有活血柔肝、利濕止痛等功效，用于治療慢性肝炎等疾病，但關(guān)于其化學(xué)成分的國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道甚少。該藥材在民間應(yīng)用廣泛，而有效成分尚未明了，所以研究其化學(xué)成分，闡明其有效部位，對(duì)其用藥安全和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善具有十分重要的意義。在前期研究的基礎(chǔ)上[2-3]，為進(jìn)一步明確白楸有效成分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該藥材乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行研究，共分離鑒定出15個(gè)化合物，均為首次分離得到。此外，將分離量較大的9個(gè)化合物進(jìn)行體外抗HBV活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)3個(gè)具有一定作用。

1 材料

RE-52B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；LGJ-10FD型冷凍干燥機(jī)(山東淄博森源電氣有限公司)；RDY-2B 型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司)；Inova 500 MHz核磁共振儀(美國(guó)Thermo公司)；VG Zabspec 高分辨磁質(zhì)譜儀(英國(guó)Micromass公司)；AE523型電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；HBS-1096C型酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；QP-80型二氧化碳孵箱(山東濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司)。

Sephadex LH-20凝膠(上海宏真生物科技有限公司)；H60硅膠(青島海洋化工廠)；HBeAg ELISA試劑盒(北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司， 批號(hào)201701005)；HBsAg ELISA試劑盒(北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司， 批號(hào)201801001)；DMEM 培養(yǎng)基(北京華邁科生物技術(shù)有限公司)；拉米夫定(美國(guó)葛蘭素史克公司，批號(hào) K026520，純度>99%)；噻唑藍(lán)(MTT，武漢卡諾斯科技有限公司)；胎牛血清(上海齊一生物科技有限公司)。HepG2.2.15 細(xì)胞株(美國(guó)Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn))。所用試劑均為分析純。

白楸Mallotuspaniculatus(Lam.) Muell. Arg.采自南寧市郊外，由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園藍(lán)鳴生教授鑒定為正品。

2 提取與分離

取陰干后的藥材(根部)適量，粉碎成粗粉，取10.5 kg至提取罐中，加入70%乙醇適量，水浴加熱回流提取3次(1.5 h/次)，將3次提取液進(jìn)行合并，減壓濃縮得浸膏967.6 g。將上述浸膏置萃取罐中，加適量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各部位分別萃取3次，合并萃取液，濃縮干燥后得石油醚部位83.7 g、乙酸乙酯部位103.6 g、正丁醇部位168.2 g。取乙酸乙酯部位90 g，用2倍量硅膠拌樣，上硅膠柱，氯仿-甲醇(100∶0～0∶1)梯度洗脫，洗脫液用薄層色譜跟蹤檢測(cè)，合并相似流分，減壓濃縮后共得8個(gè)組分，記為Fr.1～ Fr.8。

取Fr.3(19.6 g)經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(20∶1、10∶1、5∶1)梯度洗脫，薄層檢測(cè)合并減壓濃縮得Fr.3-1～ Fr.3-6。Fr.3-2(2.4 g)經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(20∶1、15∶1)梯度洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮得Fr.3-2.1～Fr.3-2.5。取Fr.3-2.2(0.4 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(18∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物1(8.5 mg)；取Fr.3-2.3(0.8 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(16∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物2(11.8 mg)；取Fr.3-2.5(0.2 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(15∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物3(1.3 mg)。取Fr.3-5(2.8 g)經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(10∶1、5∶1)梯度洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮得Fr.3-5.1～Fr.3-5.6。取Fr.3-5.2(0.3 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(10∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物4(6.2 mg)；取Fr.3-5.4(0.5 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(8∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物5(13.6 mg)；取Fr.3-5.5(0.4 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(6∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物6(17.4 mg)。

取Fr.5(21.7 g)經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(10∶1、5∶1、3∶1)梯度洗脫，薄層檢測(cè)合并減壓濃縮得Fr.5-1～ Fr.5-5。取Fr.5-3(3.9 g)經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(9∶1、3∶1)梯度洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮得Fr.5-3.1～Fr.5-3.6。取Fr.5-3.2(0.6 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(6∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物7(12.9 mg)；取Fr.5-3.4(0.5 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(4∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物8(13.2 mg)。取Fr.5-4(1.8 g)經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(8∶1、3∶1)梯度洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮得Fr.5-4.1～Fr.5-4.5。取Fr.5-4.3(0.2 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(6∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物9(1.2 mg)；取Fr.5-4.4(0.1 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(4∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物10(0.9 mg)。取Fr.5-5(3.2 g)經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(8∶1，3∶1)梯度洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮得Fr.5-5.1～Fr.5-5.7。取Fr.5-5.3(0.3 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(6∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物11(16.6 mg)；取Fr.5-5.5(0.1 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(5∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物12(1.1 mg)；取Fr.5-5.6(0.2 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(4∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物13(1.5 mg)。

取Fr.6(30.9 g)經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(8∶1、5∶1、2∶1)梯度洗脫，薄層檢測(cè)合并減壓濃縮得Fr.6-1～ Fr.6-8。取Fr.6-1(5.7 g)經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(8∶1、3∶1)梯度洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮得Fr.6-1.1～Fr.6-1.5。取Fr.6-1.1(0.2 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(7∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物14(1.3 mg)；取Fr.6-1.4(0.3 g)，經(jīng)硅膠柱氯仿-甲醇(4∶1)洗脫，Sephadex LH-20柱純化得化合物15(14.7 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無(wú)色針狀結(jié)晶(丙酮)；mp 158～159 ℃；ESI-MSm/z: 425.3[M+H]+, 423.2[M-H]-，推測(cè)分子量424。1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 5.23 (1H, t,J=4.3 Hz, H-12), 0.82～1.16(each 3H, s, 23～30-CH3)；13C-NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 39.6(C-1), 34.8(C-2), 216.5 (C-3), 47.8(C-4), 55.7(C-5), 20.4(C-6), 33.4(C-7), 40.2(C-8), 48.3(C-9), 37.5(C-10), 24.1(C-11), 122.9(C-12), 145.6(C-13), 42.3(C-14), 28.5(C-15), 26.7(C-16), 32.6(C-17), 47.6(C-18), 47.9 (C-19), 31.4(C-20), 35.0(C-21), 37.5(C-22), 28.0(C-23), 21.6(C-24), 15.4(C-25), 17.5(C-26), 26.3(C-27), 27.3(C-28), 33.4(C-29), 23.9(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]基本一致，故鑒定為β-香樹(shù)脂酮。

化合物2：白色針狀結(jié)晶(環(huán)已烷)；mp 230～231 ℃；Liebermann-Burchard 反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z: 485.4[M+H]+, 483.2[M-H]-，推測(cè)分子量484。1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 0.86～1.17(each 3H, s, 23～27, 29～30-CH3), 2.07(3H, s, -COCH3), 3.21(1H, d,J=10.8 Hz)，3.57(1H, d,J=10.8 Hz)(28-CH2OH), 4.52 (1H, t, H-3), 5.19 (1H,m, H-12)；13C-NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 38.5(C-1), 25.6(C-2), 80.7(C-3), 37.8(C-4), 55.5(C-5), 18.4(C-6), 32.6(C-7), 39.8(C-8), 47.5(C-9), 36.8(C-10), 23.2(C-11), 122.5(C-12), 144.3(C-13), 41.8(C-14), 25.5(C-15), 22.3(C-16), 36.5(C-17), 42.6(C-18), 46.6(C-19), 30.9(C-20), 34.1(C-21), 31.3(C-22), 28.3(C-23), 15.5(C-24), 15.6(C-25), 16.9(C-26), 26.3(C-27), 70.0(C-28), 33.5(C-29), 23.9(C-30), 21.2(-COCH3), 171.1(-COCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]基本一致，故鑒定為高根二醇-3-醋酸酯。

化合物3：白色粉末；ESI-MSm/z: 427.2[M+H]+, 471.1 [M+HCOO]-，推測(cè)分子量426。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 1.93, 1.64 (H-1), 2.37, 2.25 (H-2), 2.23 (H-4), 1.73, 1.24(H-6), 1.47, 1.36(H-7), 1.37 (H-8), 1.52 (10-H), 1.47, 1.23 (H-11), 1.32, 1.34 (H-12), 1.46, 1.25 (H-15), 1.57 (18-H), 1.39, 1.21 (H-19), 1.51, 1.28 (H-21), 1.48, 0.91 (H-22), 0.89 (23-CH3), 0.73 (24-CH3), 0.88 (25-CH3), 1.02 (26-CH3), 1.05 (27-CH3), 1.18 (28-CH3), 1.03 (29-CH3), 0.96 (30-CH3)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 213.4(C-3), 59.6(C-10), 58.3(C-4), 53.2(C-8), 42.8(C-18), 42.2(C-5), 41.5(C-2), 41.2(C-6), 39.8(C-13), 39.5(C-22), 38.4(C-14), 37.4(C-9), 35.8(C-16), 35.7(C-11), 35.3(C-19), 35.1(C-30), 32.8(C-15), 32.4(C-21), 32.3(C-28), 31.8(C-29), 30.5(C-12), 29.9(C-17), 28.5(C-20), 22.5(C-1), 20.6(C-26), 19.0(C-27), 18.5(C-7), 17.8(C-25), 14.9 (C-24), 7.0(C-23)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致，故鑒定為軟木三萜酮。

化合物4：黃色針狀結(jié)晶(甲醇)；mp 155～156 ℃；ESI-MSm/z: 439.3[M+H]+, 437.4[M-H]-，推測(cè)分子量438。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 1.63(3H, d,J=6.5 Hz, H-2″), 4.81(1H, d,J=6.5 Hz, H-1″), 6.32 (1H, s, H-6), 6.65(1H, d,J=8.5 Hz, H-6?), 6.68(1H, d,J=8.5 Hz, H-5?), 6.72 (1H, s, H-2?), 6.89(1H, d,J=8.5 Hz, H-5′), 7.21 (1H, s, H-6′), 7.81(1H, d,J=1.8 Hz, H-2′)；13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 146.9(C-2), 135.3(C-3), 176.6(C-4), 158.2(C-5), 98.5(C-6), 161.3(C-7), 111.3(C-8), 154.2(C-9), 103.4(C-10), 122.3(C-1′), 115.4(C-2′), 145.5(C-3′), 147.8(C-4′), 115.2(C-5′), 119.5(C-6′), 31.9(C-1″), 17.8(C-2″), 134.9(C-1?), 114.6(C-2?), 142.9(C-3?), 144.5(C-4?), 117.4(C-5?), 115.5(C-6?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致，故鑒定為8-[1-(3,4-二羥基苯基)乙基]-槲皮素。

化合物5：黃色簇狀晶體(吡啶)；mp>350 ℃;ESI-MSm/z: 303.3[M+H]+，301.2[M-H]-，推測(cè)分子量302。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.46 (2H, s, H-5, 5′)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 107.9(C-1, 1′), 140.5(C-2, 2′), 130.6(C-3, 3′), 149.3(C-4, 4′), 110.7(C-5, 5′), 112.1(C-6, 6′), 159.5(C-7, 7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定為鞣花酸。

化合物6：白色針狀結(jié)晶(甲醇)；mp 296～297 ℃；Liebermann-Burchard 反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z: 499.4[M+H]+, 497.2[M-H]-，推測(cè)分子量498。1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 0.86(3H, s, 23-CH3), 0.89(3H, s, 24-CH3), 0.93(6H, s, 2CH3), 0.95(6H, s, 2CH3), 2.06(3H, s, -COCH3), 2.28(1H, dd,J=3.2, 14.3 Hz),2.39(1H, dd,J=8.1, 14.3 Hz)(16-CH2), 4.47 (1H, t, H-3), 5.52(1H, dd, H-15)；13C-NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 37.8(C-1), 23.6(C-2), 80.9(C-3), 37.7(C-4), 55.6(C-5), 18.7(C-6), 40.8(C-7), 39.3(C-8), 49.2(C-9), 37.9(C-10), 17.5(C-11), 33.5(C-12), 37.6(C-13),160.8(C-14), 116.7(C-15), 31.4(C-16), 51.6(C-17), 41.3(C-18), 35.5(C-19), 29.7(C-20), 33.9 (C-21), 30.8(C-22), 27.6(C-23), 16.9(C-24), 15.8(C-25), 26.5(C-26), 22.3(C-27), 184.6(C-28), 32.0(C-29), 28.9(C-30), 21.3(-COCH3), 171.4(-COCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為乙?；屯┧?。

化合物7：白色固體(甲醇)；mp 155～156 ℃；ESI-MSm/z: 185.2[M+H]+, 183.1[M-H]-，推測(cè)分子量184。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 3.32 (3H, s,-OCH3), 6.91 (1H, s, H-2, 6), 8.93 (1H, s, 3-OH), 9.18 (1H, s, 3, 5-OH)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 108.6(C-3,5),119.6(C-1),138.8(C-4), 145.9(C-2, 6), 166.5(C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定為4-O-甲基沒(méi)食子酸。

化合物8：白色針狀結(jié)晶(甲醇)；mp 236～237 ℃；5%FeCl3反應(yīng)呈陽(yáng)性；ESI-MSm/z: 171.2[M+H]+, 169.3[M-H]-，推測(cè)分子量170。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 6.91(2H, s, H-2, 2″), 8.89(1H, s, -OH), 9.23(2H, s, -OH), 12.42(1H, s, -COOH), 經(jīng)與沒(méi)食子酸對(duì)照品TLC檢測(cè)，3種不同溶劑系統(tǒng)展開(kāi)，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)顏色、形狀相同，Rf值一致，故鑒定為沒(méi)食子酸。

化合物9：無(wú)色粉末(甲醇)；ESI-MSm/z: 303.2[M+H]+, 301.3[M-H]-。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 7.02 (1H, d,J=8.9 Hz, H-6), 6.52 (1H, d,J=2.5 Hz, H-5), 6.35 (1H, dd,J=6.3, 2.6 Hz, H-3), 3.84 (3H, s, 2-OCH3), 4.77 (1H, d,J=1.7 Hz, H-1′), 3.31～3.95 (6H, m, Hs-sugar)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 141.7(C-1), 152.8(C-2), 104.6(C-3), 155.3(C-4), 108.2(C-5), 120.6(C-6), 102.5(C-1′), 75.9(C-2′), 78.7(C-3′), 72.0(C-4′), 78.2(C-5′), 62.9(C-6′), 56.8(2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為異它喬糖苷。

化合物10：白色無(wú)定形粉末(甲醇)；ESI-MSm/z: 697.2[M+Na]+, 1 347.4[M-H]-；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 8.12 (1H, s, H-5), 7.05 (1H, m, H-8), 6.96 (1H, d,J=7.9 Hz, H-5′), 6.82(1H, s, H-2′), 6.77 (1H, s, 6′-H), 6.06 (1H, d,J=4.5 Hz, H-12β), 5.79 (1H, d,J=15.5, H-12α), 4.03 (3H, s, 6-OCH3), 3.72 (7-OCH3), 6.05 (1H, d,J=6.5 Hz, -OCH2O), 5.43 (1H, dd,J=15.5, 4.5 Hz,-OCH2O), 5.45 (1H, d,J=7.9 Hz, H-1″), 4.77 (1H, d,J=6.7 Hz, H-1?), 3.42～4.23 (11H, m, sugar-Hs)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 138.2(C-1), 120.9(C-2), 133.5(C-3), 146.8(C-4), 103.5(C-5), 154.0(C-6), 152.2(C-7), 107.3(C-8), 129.7(C-9), 132.2(C-10), 172.7(C-11), 70.2(C-12), 130.9 (C-1′), 112.6(C-2′), 149.8(C-3′, 4′), 109.5(C-5′), 125.3(C-6′), 102.8(C-7′), 57.5(6-OCH3), 56.6(7-OCH3), 105.5(C-1″), 73.0(C-2″), 77.9(C-3″), 70.8(C-4″), 78.7(C-5″), 67.2(C-6″), 103.1(C-1?), 71.9(C-2?), 75.3(C-3?), 68.8(C-4?), 67.6(C-5?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為mananthoside I。

化合物11：淡黃色粉末(甲醇-水)；Molish 反應(yīng)呈陽(yáng)性；ESI-MSm/z: 271.2[M+H]+, 269.3[M-H]-。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.94(2H, d,J=8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.98(2H, d,J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.83(1H, s, H-3), 6.43(1H, d,J=2.5 Hz, H-6), 6.79(1H, d,J=2.5 Hz, H-8), 5.05～3.28(H-glucose)；13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 164.3(C-2), 103.2(C-3), 182.2(C-4), 161.6(C-5), 99.8(C-6), 163.0(C-7), 94.7(C-8), 156.9(C-9), 105.5(C-10),121.3(C-1′),128.6(C-2′), 116.2(C-3′), 161.3(C-4′), 116.2 (C-5′), 128.7(C-6′), 63.5～99.6(C-glucose), 170.42(-C=O), 20.93(-CO-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為洋芹素-7-O-β-D-(6″-O-乙?；?-葡萄糖苷。

化合物12：白色粉末；ESI-MSm/z: 803.4[2M+Na]+, 779.3[M-H]-。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 0.79, 0.85 (each 3H, s, 12, 13-CH3), 0.93 (3H, s, 11-CH3), 1.23 (3H, s, 10-CH3), 1.47(1H, m, H-4ax), 1.55 (1H, dd,J=12.9, 7.5 Hz, H-2eq), 1.65 (1H, m, H-2ax), 1.87 (1H, d,J=12.5 Hz, H-4eq), 1.96 (1H, m, H-5), 3.97 (1H, m, H-3), 4.25 (1H, t,J=12.5, 6.5 Hz, H-9), 4.37 (1H, dd,J=7.9, 2.5 Hz, H-1), 5.57 (1H, dd,J=15.5, 6.5 Hz, H-7), 5.75 (1H, dd,J=15.9, 5.7 Hz, H-8), 3.12～3.89 (6H, m, Hs-sugar)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 40.9(C-1), 43.5(C-2), 76.1(C-3), 38.6(C-4), 36.5(C-5), 79.0(C-6), 134.7(C-7), 136.5(C-8), 69.8(C-9), 24.9(C-10), 25.6(C-11), 26.7(C-12), 17.5(C-13), 103.3(C-1′), 75.6(C-2′), 78.6(C-3′), 72.2(C-4′), 78.4(C-5′), 63.5(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定為turpinionoside A。

化合物13：淡黃色粉末(甲醇-水)；ESI-MSm/z: 565.2[M+H]+, 563.1[M-H]-。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.05(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′, 6′), 6.89(2H, d,J=7.5 Hz, H-3′, 5′), 6.82(1H, s,H-3)；13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 163.6(C-2), 104.0(C-3), 182.5(C-4), 158.7(C-5), 108.8(C-6), 161.3(C-7), 103.9(C-8), 155.2(C-9), 103.6(C-10), 122.3(C-1′),129.5(C-2′),116.4(C-3′), 161.2(C-4′), 116.8(C-5′), 129.4(C-6′), 74.6(C-1″), 70.5(C-2″), 75.1(C-3″), 70.3(C-4″), 71.6(C-5″), 74.7(C-1?), 71.0(C-2?), 73.9(C-3?), 70.9(C-4?), 81.7(C-5?), 61.4 (C-6?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為corymboside。

化合物14：白色無(wú)定形粉末(甲醇)；ESI-MSm/z: 505.3[M+Na]+, 963.2[M-H]-。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ:5.27 (1H, d,J=4.5 Hz, H-1), 2.94 (1H, dd,J=7.9, 4.5 Hz, H-2), 3.85 (1H, dd,J=12.9, 8.5 Hz, H-3α), 3.67 (1H, dd,J=10.5, 5.9 Hz, H-3β), 6.77 (1H, s, H-2′), 6.55 (1H, d,J=7.5 Hz, H-5′), 6.67 (1H, dd,J=8.5, 2.5 Hz, H-6′), 6.76 (1H, s, H-2″), 6.57 (1H, d,J=7.5 Hz, H-5″), 6.63 (1H, dd,J=8.5, 2.5 Hz, H-6″), 3.64 (3H, s, 3′-OCH3), 3.75 (3H, s, 3″-OCH3), 4.16 (1H, d,J=7.5 Hz, H-1?), 3.12～4.25 (6H, m, H-sugar);13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:78.8(C-1),56.6(C-2),64.6(C-3),133.5(C-1′),113.4(C-2′), 149.0(C-3′), 146.9(C-4′), 115.7(C-5′), 121.9(C-6′), 131.7(C-1″), 115.8(C-2″), 148.9(C-3″), 146.4(C-4″), 115.9(C-5″), 124.0(C-6″), 56.9(3′-OCH3), 56.6(3″-OCH3), 101.8(C-1?), 75.7(C-2?), 79.8(C-3?), 72.9(C-4?), 78.5(C-5?), 63.7(C-6?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定為hovetrichoside A。

化合物15：白色無(wú)定形粉末(甲醇)；5%FeCl3反應(yīng)呈陽(yáng)性；ESI-MSm/z: 485.1[M+H]+, 483.3[M-H]-，推測(cè)分子量484；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:6.96(2H,s,H-2′, 6′),7.02(2H,s,H-2″,6″), 3.33～5.57(H-glucose)；13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 118.9(C-1′, 1″),109.2(C-2′, 6′), 109.2(C-2″, 6″), 145.6(C-3′, 5′), 145.6(C-3″, 5″), 139.1(C-4′, 4″), 63.3～94.5(C-glucose), 164.9(7′, 7″-C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定為1,6-二-O-沒(méi)食子?；?β-D-葡萄糖。

4 體外抗HBV活性測(cè)試

選擇生長(zhǎng)良好的HepG2.2.15細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，以1×105/mL密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(200 μL/孔)，培養(yǎng)24 h(37 ℃，5%CO2)。取分離量較大的9個(gè)化合物和拉米夫定(陽(yáng)性對(duì)照藥物)，適量DMSO溶解，DMEM培養(yǎng)液稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80、160 μg/mL的溶液，加到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，培養(yǎng)96 h后換相同質(zhì)量濃度的藥物培養(yǎng)液(每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3孔，200 μL/孔)，收集用藥后192 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照HBeAg、HBsAg ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定吸光度值，計(jì)算抗原抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)[18]，MTT法進(jìn)行藥物細(xì)胞毒性測(cè)試，計(jì)算細(xì)胞存活率和半數(shù)細(xì)胞毒濃度(CC50)[19]。結(jié)果顯示，化合物4、8對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌表面抗原HBsAg有一定抑制作用，IC50分別為(95.8±2.6)、(82.7±3.1) μg/mL；化合物15對(duì)細(xì)胞分泌E抗原HBeAg的分泌有顯著抑制作用，IC50為(12.9±1.7) μg/mL，見(jiàn)表1。

表1 各化合物體外抗HBV活性

5 討論

從體外抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，化合物4、8、15具有抗HBV活性，即白楸對(duì)肝炎具有治療作用，也與民間用藥經(jīng)驗(yàn)相一致，具有可溯源性，表明該藥材具有良好的開(kāi)發(fā)利用前景。從目前的成分研究結(jié)果來(lái)看，白楸所含化合物大多為有機(jī)酸類、萜類及黃酮類，與前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，僅有少數(shù)化合物有抗HBV活性，而且只是從某一提取部位分離得到的化合物，不足以全面反映該藥材的藥理作用機(jī)制，下一步應(yīng)對(duì)其他萃取部位進(jìn)行全面的化學(xué)成分分析，闡明藥理作用機(jī)制，以期為該藥材的深度開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。