維格列汀對(duì)糖尿病足潰瘍大鼠創(chuàng)面修復(fù)的影響*

王曉娟 曹海泉 袁寧 何明海

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 1.內(nèi)分泌科；2.重癥醫(yī)學(xué)科，四川 南充 637000)

創(chuàng)面是由于有害因素導(dǎo)致活體組織功能連續(xù)性中斷所致的最常見(jiàn)的臨床情況[1]。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer,DFU)是糖尿病患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，與神經(jīng)病變、腎病、心肌病變、血管病變、酮癥酸中毒并列[2]。一份統(tǒng)計(jì)報(bào)告表明DFU的年發(fā)病率約為2%，在糖尿病人群中患病率約為4.5%～10%，66%的DFU患者需要住院治療[3-4]。由于糖尿病患者發(fā)生DFU的風(fēng)險(xiǎn)增加，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，同時(shí)也給醫(yī)療系統(tǒng)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，患有DFU的2型糖尿病患者每年的直接和間接醫(yī)療費(fèi)用約為13561美元[3]。證據(jù)表明導(dǎo)致傷口愈合延遲的各種因素包括血糖水平升高、胰島素抵抗增加、血管生成和膠原沉積減少[5]。此外，創(chuàng)面的炎性浸潤(rùn)及炎性因子的平衡在DFU的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用[6]。有報(bào)道指出，維格列汀在治療糖尿病方面具有較好的效果[7]，但關(guān)于其對(duì)DFU創(chuàng)面修復(fù)的研究還尚未清晰?；诖?，本研究觀察維格列汀對(duì)DFU大鼠創(chuàng)面修復(fù)的影響，為其治療DFU提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雌性健康、清潔級(jí)SD大鼠90只，體質(zhì)量(210±10)g,購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，使用許可證號(hào)：SCXK(川)2019-031。飼養(yǎng)于恒溫(20～25 ℃)、恒濕(50%±5%)環(huán)境中，自然采光，自由飲水。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為9組：空白組(3、6、9 d組)、模型組(糖尿病鼠足潰瘍)(3、6、9 d組)、維格列汀組(給藥3、6、9 d組)，每組各10只。本實(shí)驗(yàn)大鼠的處理符合動(dòng)物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、同意。

1.2 主要試劑及設(shè)備 維格列汀購(gòu)自諾華公司(批號(hào)：H20160037)；白細(xì)胞介素-6(IL-6,貨號(hào)：ZC-36404)、腫瘤壞死因子α(TNF-α，貨號(hào)：ZC-37624)ELISA 試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；蘇木素染液(批號(hào)：C200301)、伊紅染液(批號(hào)：C200403)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF,貨號(hào)：ab32152)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF,貨號(hào)：ab184265)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,貨號(hào)：ab40772)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF,貨號(hào)：ab208687)一抗抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam;過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(上海晶天生物)、BMJ-A型包埋機(jī)購(gòu)自常州郊區(qū)中威電子儀器廠；SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DFU大鼠模型的建立及給藥 大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1 w后，進(jìn)行模型制備，除空白組外，其余大鼠造模，造模前大鼠禁食12 h,但可飲水，造模大鼠采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4～6 w,大鼠腹腔注射鏈脲佐菌(STZ)30 mg/kg誘發(fā)罹患糖尿病，用藥72 h后，自尾靜脈微量采血檢測(cè)隨機(jī)血糖，當(dāng)血糖值超過(guò)16.7 mmol/L,即為糖尿病大鼠造模成功。隨后造模大鼠用10%戊巴比妥鈉麻醉，背部剃毛、消毒，大鼠背側(cè)后足上形成單個(gè)圓形全層皮膚潰瘍創(chuàng)面?zhèn)冢?～3 d后傷口局部皮膚壞死，形成DFU,造模完成?？瞻捉M大鼠正常飼料飼喂，大鼠創(chuàng)面造模成功后24 h,空白組和模型組灌胃雙蒸水(10 mg/kg)，維格列汀組灌胃維格列汀(57 mg/kg)，1次/d,分別于給藥后的3、6、9 d,剪取創(chuàng)面部位潰瘍皮膚標(biāo)本。

1.3.2 大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察 采集創(chuàng)面組織標(biāo)本，4%多聚甲醛溶液固定，固定的創(chuàng)面組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，包埋，切片，放入蘇木精中染色約10 min,自來(lái)水沖洗使切片顏色變藍(lán)，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘，使細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，1%氨水中數(shù)秒，至返藍(lán)，1%伊紅染色3 min左右，脫水，透明，中性樹(shù)膠封存，鏡檢觀察組織病理變化。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清炎性因子表達(dá) 按照ELISA試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6表達(dá)水平。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)創(chuàng)面組織VEGF、EGF、E-cadherin、bFGF表達(dá) 創(chuàng)面組織切片，脫臘后3% H2O2室溫孵育30 min,滴加正常山羊血清后37 ℃孵育30 min,滴加一抗(VEGF、EGF、E-cadherin、bFGF)，37 ℃孵育1 h,滴加相應(yīng)二抗，繼續(xù)孵育30 min。然后DAB顯色、蘇木精復(fù)染、酒精鹽酸分化、脫水、中性樹(shù)膠封片，觀片，以Image-pro plus 6.0 軟件處理和分析圖像，統(tǒng)計(jì)IOD值。

2 結(jié)果

2.1 維格列汀對(duì)DFU大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化的影響 空白組大鼠在灌胃3、6、9 d時(shí)皮膚組織表皮結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞排列整齊緊密，胞質(zhì)紅染、均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯病理變化。模型組大鼠在造模成功3 d時(shí)創(chuàng)面組織內(nèi)表皮、真皮、皮下脂肪層大面積壞死脫落，細(xì)胞形態(tài)基本消失；于6 d時(shí)創(chuàng)面組織內(nèi)表皮中復(fù)層扁平上皮層明顯增厚，表皮層細(xì)胞壞死，胞核崩解，胞核固縮崩解；于9 d時(shí)創(chuàng)面組織復(fù)層扁平上皮層明顯增厚，嗜酸性增強(qiáng)，毛囊和皮脂腺等皮膚附屬器基本壞死消失，表皮表面覆有由變性壞死細(xì)胞及出血混合而成的痂皮，真皮層較多大量膠原纖維壞死，壞死區(qū)域可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。維格列汀治療3 d時(shí)創(chuàng)面組織內(nèi)表皮中復(fù)層扁平上皮層明顯增厚，表皮層細(xì)胞壞死，胞核崩解，見(jiàn)表皮表面覆有由變性壞死細(xì)胞及出血混合而成的痂皮；于6 d時(shí)表皮層細(xì)胞壞死，表皮表面覆有由變性壞死細(xì)胞及出血混合而成的痂皮，真皮層較多膠原纖維壞死，出血；治療9 d時(shí)真皮層膠原纖維壞死區(qū)域可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維細(xì)胞增生，亦可見(jiàn)新生毛細(xì)血管形成，皮下肌層清晰可見(jiàn)，胞核形態(tài)正常，其他未見(jiàn)明顯病理變化；與模型組9 d時(shí)相比，病理?yè)p傷明顯改變，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化(HE,100×，400×)Figure 1 Histopathological changes in wounds of rats in each group 注：A.3 d處理組；B.6 d處理組；C.9 d處理組

2.2 對(duì)DFU大鼠血清炎性因子表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平在3、6、9 d時(shí)均明顯升高 (P<0.05)；與模型組比較，維格列汀治療3、6、9 d可明顯降低IL-6、TNF-α水平 (P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清炎性因子表達(dá)Table 1 The expression of serum inflammatory factors in each group of rats

2.3 維格列汀對(duì)DFU大鼠創(chuàng)面血管再生的影響 與空白組比較，模型組EGF、VEGF表達(dá)在3、6、9 d時(shí)均明顯降低 (P<0.05)；與模型組比較，維格列汀治療3、6、9 d可明顯升高EGF、VEGF表達(dá) (P<0.05)。見(jiàn)表2、表3。

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織EGF表達(dá)Table 2 Expression of EGF in wound tissue of rats in each group

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織VEGF表達(dá)比較Table 3 Expression of VEGF in wound tissue of rats in each group

2.4 維格列汀對(duì)糖尿病足潰瘍大鼠創(chuàng)面再上皮化的影響 與空白組比較，模型組bFGF、E-cadherin表達(dá)在3、6、9 d時(shí)均明顯降低 (P<0.05)；與模型組比較，維格列汀治療3、6、9 d可明顯升高bFGF、E-cadherin表達(dá) (P<0.05)。見(jiàn)表4、表5。

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織bFGF表達(dá)Table 4 Expression of bFGF in wound tissues of rats in each group

表5 各組大鼠創(chuàng)面組織E-cadherin表達(dá)Table 5 Expression of E-cadherin in wound tissue of rats in each group

3 討論

DFU是一種慢性難治性臨床疾病，主要受炎癥反應(yīng)受損和血糖升高的影響導(dǎo)致傷口延遲愈合。目前治療DFU的方法包括神經(jīng)治療藥物(抗生素、生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落刺激因子)、物理療法(如高壓氧、電物理和負(fù)壓療法)以及先進(jìn)的生物工程皮膚替代物等[8]。然而，較高的費(fèi)用和無(wú)應(yīng)答率限制了其在DFU治療中的臨床應(yīng)用。王邦瓊等[9]研究證明維格列汀在治療糖尿病方面具有較好的效果，可能是治療DFU的一種有前途的選擇。在各種動(dòng)物模型中，STZ誘導(dǎo)的模型重復(fù)性較高，可模擬大多數(shù)延遲傷口愈合的臨床病理?xiàng)l件，包括再上皮化、傷口閉合和生長(zhǎng)因子形成[10]。本研究結(jié)果顯示，維格列汀干預(yù)后大鼠創(chuàng)面組織內(nèi)表皮中復(fù)層扁平上皮層有所增厚，皮下肌層清晰可見(jiàn)，胞核形態(tài)正常，較模型組病理組織學(xué)明顯改善，提示維格列汀對(duì)DFU具有改善作用，可成為治療DFU的潛在藥物。

研究報(bào)道炎癥反應(yīng)在傷口愈合過(guò)程中起著中心作用，血糖水平升高會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化物產(chǎn)生過(guò)多，從而刺激炎性因子的釋放，臨床上糖尿病患者與局部傷口中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高有關(guān)[11]。且支持TNF-α和延遲愈合過(guò)程之間存在直接聯(lián)系[12]。此外，TNF-α可以抑制TGF-β的激活，從而抑制膠原-1的增殖和合成，而IL-6的增加對(duì)血管生成有負(fù)面影響[13]。本研究檢測(cè)了炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，結(jié)果表明傷口愈合延遲與傷口區(qū)域炎癥反應(yīng)加重有關(guān)，與Lin等[14]的研究結(jié)果一致。而維格列汀的應(yīng)用顯著減少了傷口處的炎性滲出，表明其具有抗炎的潛力，創(chuàng)面組織的病理學(xué)結(jié)果進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)。Bandyk[15]指出改善創(chuàng)面愈合可以洞察疾病狀況。在本研究中，維格列汀可明顯增加STZ引起的傷口收縮率，改善了傷口延遲愈合。表明維格列汀具有抗炎癥作用，進(jìn)而可以改善創(chuàng)面愈合。

VEGF被認(rèn)為是最重要的血管生成因子，可以激活成纖維細(xì)胞的增殖，通過(guò)增加膠原蛋白的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)傷口愈合[16]。然而，在糖尿病條件下，創(chuàng)面不良的血管系統(tǒng)增加了炎性因子的合成，從而抑制依賴(lài)VEGF的膠原合成，延遲傷口的愈合。此外，一系列病理生理因素可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，從而導(dǎo)致血管生成障礙[17]。有學(xué)者認(rèn)為糖尿病在傷口愈合過(guò)程中會(huì)誘導(dǎo)有缺陷的血管生成反應(yīng)，VEGF可與Ang-1/Tie-2相互作用通過(guò)誘導(dǎo)小管形成、內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管退化在血管生成中發(fā)揮重要作用[18]。EGF是由血小板、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌，其可激活內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及層粘連蛋白的沉積[19]。而bFGF是一種有效的促分裂原，因其可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖能力而被命名，bFGF的一種糖蛋白可促進(jìn)血管再生，下調(diào)膠原Ⅰ和彈性蛋白表達(dá)，并上調(diào)皮膚成纖維細(xì)胞中的透明質(zhì)酸合成來(lái)促進(jìn)傷口愈合[20]。研究顯示EGF和bFGF在慢性潰瘍創(chuàng)面中水平降低，EGF和bFGF水平的上調(diào)可以促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面細(xì)胞增殖進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合[21]。此外，細(xì)胞間黏附分子在調(diào)節(jié)皮膚再生性修復(fù)過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，E-cadherin可與β-catenin相互作用參與傳導(dǎo)核內(nèi)信號(hào)影響細(xì)胞的黏附性調(diào)節(jié)，同時(shí)參與角化形成細(xì)胞的黏著和成熟化，提示其可能參與調(diào)控創(chuàng)傷愈合再上皮化過(guò)程[22]。本研究結(jié)果顯示，腹腔注射STZ可顯著下調(diào)VEGF、EGF、bFGF、E-cadherin的表達(dá)，而維格列汀治療明顯提高了VEGF、EGF、bFGF、E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了維格列汀在促進(jìn)傷口愈合方面的作用。

4 結(jié)論

維格列汀對(duì)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合具有潛在作用，其通過(guò)抑制炎性因子(TNF-α、IL-6)、增加血管再生因子(VEGF、EGF)、再上皮化因子(bFGF、E-cadherin)發(fā)揮其潛能，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。但維格列汀對(duì)創(chuàng)面愈合的影響具體通過(guò)哪些信號(hào)通路發(fā)揮作用，還有待后續(xù)深入研究。